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质体和线粒体为半自主性的细胞器,自身携带遗传物质。这些遗传物质以非孟德尔的方式遗传,也被称作细胞质遗传。传统的观念认为,非孟德尔遗传即为单亲母系遗传。但近年的研究发现,尽管线粒体的单亲母系遗传在真核生物中占据绝对的优势,却有约20%的被子植物呈现明显的质体双亲遗传倾向(潜能)。这一事实说明细胞质基因组的非孟德尔遗传以单亲母系的方式为主,同时呈现不可忽视的双亲遗传现象。此外,非孟德尔遗传现象发现于近一百年前,但至今分子调控机制不详,模式植物中也未发现相关的突变体。
本研究首先选用两种豆科(Leguminosae)植物:紫藤(Wisteria sinensis)和洋槐(Robinis pseudoacacia)为实验材料,揭示了它们的细胞质遗传特性。实验首先对这两种植物的成熟花粉进行DAPI染色,发现紫藤的成熟生殖细胞中有丰富的细胞质DNA,而洋槐成熟生殖细胞中未检测到细胞质DNA。随后的线粒体亲和性荧光染色(DiOC7染色)以及电子显微术证明了紫藤生殖细胞中的细胞质DNA为质体DNA。同时,实验结果还验证了洋槐花粉第一次分裂时质体不进入生殖细胞,符合典型的质体母系遗传型特征。此外,免疫电子显微术的结果揭示了紫藤和洋槐生殖细胞中线粒体DNA在花粉发育过程中均发生降解,其相对含量分别减少了89%和92%。这些结果表明,紫藤的质体基因组具有明显的双亲遗传潜能,而洋槐的质体基因组则呈现母系遗传特征。同时,紫藤和洋槐的线粒体基因组均表现为母系遗传。
由于生殖细胞中线粒体DNA的大幅度降解是线粒体母系遗传的细胞学基础,也是线粒体母系遗传植物的共同特征,本研究继而转用玉米为实验材料,以期从大量的花粉中分离导致线粒体DNA降解的核酸酶。实验首先利用基于SDS-PAGE的酶谱法检测到玉米花粉线粒体中存在两个Mg2+和Mn2+依赖性的核酸酶M20和M30,分子量分别为20kD和30kD。不同组织线粒体的酶谱比较显示M20和M30在花粉线粒体中特异表达。
线粒体的裂解实验显示M20为水溶性蛋白,而M30的活性与线粒体不溶组分相结合。考虑到纯化的难度,本研究将M30确定为纯化对象。通过线粒体分离、硫酸铵沉淀、分子筛以及离子交换的方法,本研究初步纯化了该核酸酶,并分析了部分特征。实验结果表明,M20等电点大于7.8,具有内切酶活性,可完全降解双链和单链DNA。此外,该核酸酶在分子筛中表现出的分子量为37kD,说明其在体内可能以复合体的形式行使功能。这些结果为进一步揭示线粒体母系遗传的分子调控机制提供了重要的研究线索。为了全面了解质体、线粒体核酸酶的背景及功能,本研究还尝试了用反向遗传学方法分析可能定位于细胞器的核酸酶。从以“核酸酶”为关键词搜索拟南芥生物信息库(TAIR)的结果中,本研究筛选了14个预测定位于线粒体的核酸酶,7个预测定位于质体的核酸酶。此外,本研究针对水稻数据库,搜索了分子量为20kD左右以及等电点大于7.8的核酸酶,得到了一个具有HNH结构域的核酸酶基因(Os10g18890)。此外,序列比对发现拟南芥基因组中存在4个HNH核酸酶。以上共25个核酸酶构成本研究的候选核酸酶。基因表达芯片数据库GENEVESTIGATOR提供的数据表明候选基因AT1G11800和AT5G07810在花粉中有较高的表达。单花粉RT-PCR结果显示AT1G11800的表达在花粉发育过程中有起伏变化;A175G07810的表达量有增加的趋势。进一步的功能分析有赖于对突变体的分析。