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研究背景和目的:结直肠癌是常见的消化道肿瘤。外科切除是治疗结直肠癌的有效方法,但是切除术后癌症的复发率和转移率仍较高。因此,阐明结直肠癌发生转移的具体分子生物学机制,寻求更有效的治疗结直肠癌发生转移的新方法是肿瘤学领域的研究热点。人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2(Human Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,Rock2)是Rho家族的下游效应分子。研究发现Rock2基因在恶性肿瘤的发生和临床进展过程中起重要作用,其可以调控许多细胞生物学功能,但其在结直肠癌转移中的作用及具体作用机制仍不清楚。β-catenin是β-catenin/TCF4信号转导通路中的关键效应蛋白,其在结直肠癌的发生和转移中起重要作用。研究已经证实,β-catenin蛋白经过泛素化蛋白酶体降解。我们前期研究已经报道Rock2可以调节底物蛋白如MMP2、Cdc25A的泛素化降解过程。因此我们推测:在结直肠癌中Rock2可能通过调节β-catenin的泛素化降解过程而影响β-catenin的表达。本研究首先分析Rock2基因在结直肠癌组织中的表达及临床意义;其次通过体内外实验检测Rock2基因在结肠癌细胞侵袭和转移中的作用;然后探讨在结肠癌细胞中Rock2基因对β-catenin/TCF4通路的影响;最后明确Rock2调控β-catenin/TCF4信号通路的机制。本课题通过探讨Rock2在结直肠癌侵袭和转移中的具体作用机制,将为阐明结直肠癌侵袭转移的机制提供理论依据。方法:采用qRT-PCR、免疫组化及Western blot等方法分析116例结直肠癌组织及对应癌旁组织中Rock2基因的mRNA和蛋白表达水平,并分析Rock2蛋白表达与患者临床病理因素的关联及其对预后的影响。运用qRT-PCR和Western blot检测结直肠癌细胞株SW480,SW620,LOVO,DLD-1和HCT-116中Rock2基因的表达情况;构建4个shRock2质粒,利用qRT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰效果的shRock2质粒;采用Transwell实验、细胞划痕实验检测改变Rock2蛋白表达后对肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的影响;采用人结肠癌裸鼠原位移植瘤模型检测降低Rock2蛋白表达后对肿瘤转移能力的影响。利用westernblot和荧光素酶报告基因检测下调及上调结肠癌细胞中rock2的表达后对β-catenin蛋白及β-catenin/tcf4的转录活性的影响;另外,分别在结肠癌细胞中下调rock2表达的同时激活β-catenin/tcf4通路以及在上调rock2表达的同时阻断β-catenin/tcf4通路,利用westernblot方法检测β-catenin蛋白及相关下游靶基因的蛋白表达变化,同时利用transwell侵袭和迁移实验检测结肠癌细胞的迁移侵袭能力。利用免疫共沉淀及激光共聚焦技术,检测结肠癌细胞中β-catenin蛋白和ub之间是否存在直接相互结合;利用蛋白酶体抑制剂mg132及放线菌酮(chx)刺激的方法,在阻断蛋白降解及合成的情况下,利用westernblot检测下调及上调rock2后对β-catenin蛋白表达的影响;利用免疫共沉淀检测下调及上调rock2后对β-catenin的泛素化水平的影响。结果:qrt-pcr结果发现在结直肠癌组织中rock2基因的mrna表达比对应的癌旁正常组织明显增加(p<0.001);免疫组化检测结果显示,rock2蛋白在62.07%(72/116)的结直肠癌组织中呈高表达,而在癌旁组织中仅有11.21%(13/116)呈高表达(p<0.01);westernblot结果发现rock2蛋白在结直肠癌组织中呈明显过表达与免疫组化结果一致。另外,统计学分析发现,结直肠癌组织中rock2的高表达与患者的淋巴管浸润(p<0.001)、血管浸润(p<0.001)、淋巴结转移(p<0.001)、t分期(p<0.001)、远处转移(p=0.011)和临床分期(p<0.001)密切相关。kaplan–meier法分析5年生存曲线发现rock2高表达的结直肠癌患者的5年生存率明显低于低表达的患者(p=0.027)。在sw480和lovo结肠癌细胞中加入rock2抑制剂(y27632)和转染shrock2干扰质粒后,结果发现rock2基因的mrna和蛋白表达水平均明显下降(p<0.05),且发现肿瘤细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制(p<0.05);而在hct-116结肠癌细胞中转染rock2过表达质粒后,结果发现rock2基因的mrna和蛋白表达水平显著升高,同时发现肿瘤细胞的迁移和侵袭能力也随之增强(p<0.05)。此外,利用体内实验进一步发现稳定下调结肠癌细胞sw480中rock2基因的表达后可以降低裸鼠结肠癌远处肝转移(p<0.05)。在sw480和lovo细胞中下调rock2的表达后发现β-catenin的蛋白表达、β-catenin/tcf4的转录活性及其下游靶基因hoxb9和mmp7的蛋白表达明显降低(p<0.05),而在下调Rock2表达的同时激活β-catenin/TCF4通路结果发现可以明显恢复β-catenin、HOXB9及MMP7的蛋白表达(p<0.05)。同时,Transwell实验结果发现结肠癌细胞的侵袭和迁移能力得到恢复。另外,在HCT-116细胞中上调Rock2的表达后发现β-catenin的蛋白表达、β-catenin/TCF4的转录活性及其下游靶基因HOXB9及MMP7的蛋白表达明显增加(p<0.05),而在上调Rock2表达的同时阻断β-catenin/TCF4通路可以明显抑制β-catenin、HOXB9及MMP7的蛋白表达(p<0.05),同时Transwell实验结果发现结肠癌细胞的侵袭和迁移能力受到明显抑制(p<0.05)。4、免疫共沉淀和激光共聚焦实验发现在结肠癌细胞SW480和LOVO中β-catenin和Ub存在直接结合,且进一步发现利用蛋白酶抑制剂MG132阻断蛋白降解后,内源性β-catenin的蛋白表达量逐渐累积,说明在结肠癌细胞中β-catenin蛋白经过泛素化蛋白酶体系统降解。在阻断蛋白降解的情况下,下调或上调Rock2表达后,β-catenin蛋白表达表达无明显变化,而在阻断蛋白合成的情况下,β-catenin的降解速率明显降低,说明Rock2参与了β-catenin蛋白的降解过程。另外,我们进一步发现Rock2可以稳定β-catenin的蛋白表达。最后,我们降低结肠癌细胞中Rock2的表达后发现β-catenin蛋白的泛素化水平显著升高,而增加Rock2的表达后发现β-catenin蛋白的泛素化水平显著降低,说明Rock2通过影响β-catenin的泛素化水平而稳定β-catenin蛋白的表达。结论:Rock2在结肠癌组织中明显高表达,且与肿瘤的转移及患者的不良预后密切相关。Rock2通过调节β-catenin蛋白的泛素化降解从而促进结肠癌的侵袭和转移,为β-catenin的调控提供了一条新途径,有助于我们深入了解结直肠癌发生转移的机制。