根尖周病是口腔科最常见的炎性溶骨性疾病之一,主要是由于感染根管内的细菌或毒素进入到根尖周组织所导致。其病理特征主要表现为炎性细胞的浸润,促炎细胞因子的产生,酶的分解,破骨细胞的分化等过程,最终导致根尖周牙槽骨的破坏。牙周膜成纤维细胞是牙周组织的主要细胞类型,在牙周组织的完整性维持,功能实施及组织再生过程中发挥重要的作用。糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)是一种广泛存在的丝氨酸/氨酸蛋白激酶,最初被认定作为糖代谢的调节酶,参与糖原的代谢。GSK3β可以调节多种细胞反应,例如细胞激活、生长、分化、炎性反应及程序性死亡等。后续的研究表明,GSK3β还与许多其他细胞过程密切相关,如细胞内信号转导、基因的转录和翻译、组织细胞骨架、细胞周期进程与生存等。GSK3β的活性受到多种蛋白激酶的调节,包括PI3K,蛋白激酶A,蛋白激酶C等,它们可通过使GSK3β N-末端第9号位点的丝氨酸磷酸化,进而抑制GSK3β的活性,然后再通过相应的信号通路磷酸化下游底物而发挥其生物学功能。目前研究发现,GSK3β可以调控促炎因子核因子κＢ(NF-κB)的活性,进而调节NF-κB介导的炎性细胞因子及趋化因子的表达。研究表明GSK3β参与人和实验动物模型中的炎症性疾病,有促进炎症反应的作用,是炎症过程的一个重要因素,已经在阿尔茨海默病、糖尿病、急性肾衰竭、慢性移植肾肾病、类风湿性关节炎(RA)及癌症等疾病中得到证实。GSK3β参与炎症反应主要表现在其可以调节炎性因子的产生及炎性细胞的迁移,在许多动物实验模型及体外细胞实验中发现抑制GSK3β的活性,可下调IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等促炎细胞因子的表达,但同时抗炎细胞因子IL-10的表达增高,从而减轻炎症损伤,对机体起到保护作用。基于以上理论我们猜测GSK3β可能参与了根尖周炎的病变过程,并且抑制GSK3β的活性可以对根尖周炎起到治疗作用。本研究分为体内和体外实验两部分,体内实验拟通过建立大鼠及小鼠根尖周炎动物模型,检测GSK3β及p-GSK3β(Ser 9)在根尖周病变各个时期的表达及变化情况,并分析其与根尖周病变炎症反应及骨吸收之间的关系；同时应用GSK3β抑制剂干预小鼠根尖周炎,观察炎症反应及牙槽骨吸收的的变化情况。体外实验通过GSK3β抑制剂SB216763干预LPS刺激的人牙周膜成纤维细胞,检测炎症细胞因子和RANKL的表达情况及相关通路NF-κB的变化,以探讨GSK3β在根尖周病变中的作用及相关机制。第一部分：GSK3β在根尖周病中的表达及可能作用实验一：GSK3β在大鼠实验性根尖周炎中的表达及作用目的：观察大鼠根尖周病变过程中GSK3β的表达及变化情况,分析其与根尖周病变炎症反应及牙槽骨吸收之间的关系,并探讨其在根尖周病变中的可能作用。方法：选用成年雄性Wistar大鼠50只,随机分成0、7、14、21和28天组,全麻下在双侧下颌第一磨牙远中窝处开髓,将髓腔暴露于口腔环境,建立实验性根尖周炎动物模型。预定时间处死动物并分离下颌骨组织,通过显微CT扫描分析根尖周骨破坏情况；然后将标本制备成组织切片,通过HE染色观察根尖周炎的组织病理学变化；利用免疫组织化学、酶组织化学染色及Western blot方法检测GSK3β,p-GSK3β(Ser 9)及破骨细胞的表达与变化；利用免疫荧光双染共定位RANKL和p-GSK3β(Ser 9),并分析GSK3β、p-GSK3β(Ser 9)与破骨细胞,根尖周骨吸收及RANKL之间的关系。结果：显微CT和HE染色结果显示,从0天到28天随着病变的进展根尖周骨吸收的范围逐渐增大,0天正常组大鼠根尖周组织结构完整,无骨缺损；大鼠开髓7天后即出现根尖周骨缺损；14天、21天、28天可明显观察到根尖周骨吸收,骨破坏范围呈时间依赖关系,并向各个方向发展,并且2D骨吸收面积与3D骨吸收体积呈正相关关系。正常组根尖周组织未见炎性细胞和p·-GSK3β(Ser 9)阳性细胞；开髓7后天可见少量炎性细胞浸润,并出现少量p-GSK3β(Ser 9)阳性细胞和破骨细胞,阳性细胞数在术后14天达到高峰,从21天到28天阳性细胞逐渐减少,相关性分析提示p-GSK3β(Ser 9)与破骨细胞的表达呈正相关;GSK3β阳性细胞表达从0天到28天呈逐渐上升趋势。免疫荧光双染结果显示,根尖周病损中存在p-GSK3β(Ser 9)和RANKL共表达的细胞,该细胞在急性期表达较多,慢性期则较少。结论：GSK3β和p-GSK3β(Ser 9)共同参与了实验性大鼠根尖周炎的各个时期,提示两者在根尖周病的炎症反应和牙槽骨吸收过程中起到一定的作用。实验二：实验性小鼠根尖周炎模型的建立及GSK3p的表达目的：建立实验性小鼠根尖周炎动物模型,观察和分析病变不同时期根尖周骨缺损及炎症反应的发展变化,并检测GSK3p及相关因子在小鼠根尖周病变中的动态表达情况。方法：将42只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为6组,每组7只,在全麻下开髓(双侧下颌第一磨牙),分别于术后0、7、14、21、28和35天取下颌骨,进行高分辨率X线成像系统及显微CT扫描,分析根尖周骨吸收的动态变化情况；随后常规组织学处理颌骨标本,制备磨牙近远中向矢状切片,HE染色观察根尖部位组织病理学改变：免疫组织化学及酶组织化学检测GSK3p,p-GSK3β (Ser 9),RANKL和破骨细胞的表达与变化。结果：从0天到28天根尖周骨破坏面积和体积逐渐增大,至35天逐渐趋于稳定。HE染色示正常根尖周组织中未见炎性细胞；术后7天根尖周组织开始出现少量炎性细胞浸润并伴有牙槽骨缺损形成,疾病进入急性前期；开髓21天后,炎性细胞浸润明显,骨缺损进一步扩大,部分标本可见根尖周囊肿形成；术后28天到35天,炎性细胞浸润和骨缺损逐渐趋于平稳,无明显扩大的趋势,提示疾病进入慢性期。免疫组织化学和酶组织化学染色结果显示,在牙髓暴露7天后可见根尖周病损组织中有少量p-GSK3β(Ser 9),RANKL阳性细胞和破骨细胞表达,三者在炎症急性期(开髓后14天至21天)表达较多,随后从21天开始到35天炎症进入慢性期,p-GSK3p(Ser 9),RANKL阳性细胞和破骨细胞表达量减少并逐渐趋于稳定；GSK3β阳性细胞数从0天到28天持续增加,到术后35天逐渐趋于稳定。结论：(1)通过给小鼠磨牙开髓并暴露于口腔环境可以有效诱导根尖周骨破坏的发生,并较好的模拟了人根尖周炎的形成过程,是进行根尖周炎致病机制探讨的合适模型,为后续建立转基因小鼠根尖周炎动物模型更深入的研究根尖周炎发病机制奠定了良好的基础。(2) GSK3P和p-GSK3β(Ser 9)共同参与了小鼠根尖周炎急性和慢性期炎症反应,提示它们在小鼠根尖周病变的发生、发展和转归等过程中起到了一定的作用。实验三：GSK3p在人慢性根尖周病变的表达目的：检测GSK3β,p-GSK3p (Ser 9)及NF-κB p65在人慢性根尖周病变组织中的表达情况。方法：2013年4月至12月在武汉大学口腔医院牙体牙髓科行根尖手术或颌面外科拔牙患者中,收集到人慢性根尖周炎病损组织19例(其中根尖周囊肿9例,根尖周肉芽肿10例)及正常根尖周组织标本6例。10例病损组织用于组织学及免疫组织化学染色研究,剩余病变组织及正常根尖周组织用于提取蛋白进行Western blot分析,以观察GSK3β,p-GSK3β(Ser 9)及NF-κB p65在人根尖周组织中的表达。结果：HE染色显示人慢性根尖周病损组织主要由成纤维细胞、炎症细胞和新生的毛细血管组成,病变组织中可见大量炎性细胞浸润,主要包括淋巴细胞,中性粒细胞,单核细胞等。免疫组织化学染色结果显示GSK3β,p-GSK3β(Ser 9)及 NF-κB p65在人慢性根尖周肉芽肿及囊肿中均有表达,并且主要在炎性细胞,血管内皮细胞及成纤维细胞上表达。Western blot结果发现在正常根尖周组织中仅有少量GSK3β,p-GSK3p (Ser 9)及NF-κBp65蛋白的表达,且NF-κB p65主要在胞浆蛋白表达；与正常根尖周组织相比,慢性根尖周炎组织中GSK3β,NF-κBp65的蛋白表达显著增多,p-GSK3p(Ser 9)表达也略有增多,但幅度不大,与此同时,NF-κB p65的表达发生核转位由胞浆转移到胞核。结论：人慢性根尖周病变组织中有大量GSK3p,p-GSK3p(Ser 9)及NF-κB p65阳性细胞的的表达,提示它们参与了人慢性根尖周炎的病变发展过程。第二部分：抑制GSK3p对实验性小鼠根尖周炎的治疗作用研究实验四：GSK3β抑制剂对实验性小鼠根尖周炎的治疗作用目的：探讨GSK3β抑制剂SB216763,TDZD-8及LiCL对实验性小鼠根尖周病变中炎症反应和骨吸收的作用。方法：75只成年雄性C57BL/6小鼠被随机分成5组(N=15),包括：28天实验组(SB216763预处理组,TDZD-8预处理组,LiCL预处理组)、28天实验对照组(DMSO处理组)和0天空白对照组。在全麻下用1/4球钻开髓,实验组及实验对照组从术前一天分别给予腹腔注射SB216763(10 mg/kg), TDZD-8(1mg/kg),LiCL(100 mg/kg) 和10% DMSO(1ml/kg),每两天注射一次,直到28天处死,提取血清做ELISA检测炎症细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12,IL-17,TNF-a及IL-10的蛋白表达,然后取出含有下颌第一磨牙的下颌骨及下颌下淋巴结。其中每组5只小鼠下颌骨用于提取RNA进行Real-time PCR检测炎症细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12, IL-17,TNF-α及IL-10的基因表达；6只小鼠的标本进行高分辨率X线成像及显微CT扫描分析下颌骨骨破坏情况,然后常规组织学处理,制作组织切片,再进行组织学染色观察根尖周组织病理学改变,通过免疫组织化学染色观察p-GSK3β(Ser 9),NF-KB p65及RANKL阳性细胞的表达；4只小鼠进行茜素红(35 mg/kg)和钙黄绿素(20 mg/kg)腹腔注射,二者之间注射时间间隔3周,以检测成骨情况。结果：通过HE染色,高分辨率X线成像及显微CT扫描分析发现,和28天对照组相比,28天抑制剂预处理组牙槽骨吸收面积和体积均减小。通过ELISA和Real-time PCR检测发现,经GSK3β抑制剂处理后,促炎细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12,IL-17和TNF-α表达减少,与此同时,抗炎细胞因子IL-10表达增多。免疫组化染色发现抑制剂治疗组下颌骨组织中NF-κB p65的表达主要集中在细胞核,但较28天对照组表达减少；与28天对照组相比,抑制剂处理组p-GSK3β(ser 9)表达明显增多,RANKL表达减少。茜素红和钙黄绿素荧光骨组织染色结果显示,正常0天组小鼠根尖周新生骨组织较多,28天对照组骨破坏严重,新生骨组织较少,药物干预后新生骨组织与对照组相比增多。结论：抑制GSK3β的活性可以选择性地调节小鼠根尖周病变中抗炎和促炎因子的表达,并对破骨及成骨过程进行调节,从而改善根尖周炎症反应和骨破坏程度：表明GSK3β抑制剂SB216763,TDZD-8及LiCL对小鼠根尖周病变具有保护作用。因此,以GSK3p为靶点进行干预,有可能为根尖周病患者提供一种新的、有效的治疗方法来改善炎症反应和牙槽骨吸收。第三部分：GSK3p抑制剂对LPS刺激人牙周膜成纤维细胞表达RANKL及炎症细胞因子的影响实验五：GSK3p抑制剂对LPS刺激人牙周膜成纤维细胞表达RANKL及炎症细胞因子的影响目的：研究GSK3p抑制剂对LPS刺激人牙周膜细胞表达RANKL及炎症细胞因子的影响并探讨相关机制方法：采用组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞,GSK3p抑制剂(SB216763,10mM)预处理细胞,并用LPS刺激细胞引发炎症细胞模型,通过实时定量RT-PCR和ELISA检测hPDLFs中RANKL及炎症因子IL-1β,IL-6,IL-12, IL-17,TNF-α和IL-10的基因和蛋白表达水平；利用细胞免疫荧光染色及Westernblot方法检测NF-κB p65的表达变化。结果：原代培养得到的人牙周膜成纤维细胞经鉴定来源于中胚层。GSK3β抑制剂SB216763可以下调LPS刺激的人牙周膜成纤维细胞中R ANKL及促炎细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12,IL-17和TNF-a的表达,同时上调抗炎细胞因子IL-10的表达；免疫荧光及Western blot结果显示,LPS刺激hPDLFs可使NF-κB p65的表达由胞浆转入胞核,这种核转位现象可以被GSK3p抑制剂SB216763逆转。结论：抑制剂SB216763可以通过抑制GSK3β活性,进而抑制人牙周膜细胞中NF-κB炎症通路的激活并下调RANKL及促炎细胞因子IL-1β,IL-6,IL-12,IL-17和TNF-α的表达,同时上调抗炎细胞因子IL-10的表达,从而减轻细胞的炎症反应,对细胞起到保护作用。