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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为临床特征的病毒性传染病,又称为“猪蓝耳病”。我国自首次报道后,PRRSV在猪群中持续存在,2006年爆发的HP-PRRSV给我国带来了巨大的经济损失。本研究从广东省某疑似PRRSV发病猪场采集病料,进行RT-PCR鉴定,将确诊的阳性病料过滤后接种长满单层的Marc-145细胞,连续传代,出现明显的细胞病变(CPE),并且通过间接免疫荧光(IFA)检测为阳性,命名为PRRSV ZSBS-GD株。进一步对其全基因组进行序列测定,其核苷酸序列与高致病性代表株JXA1、中国经典毒株CH-1a、过渡态代表株HB-1(sh)/2002、北美型代表株VR-2332的同源性分别是91.3%、88.1%、89.3%、84.3%,且Nsp2具有“29+1”个氨基酸缺失的特征,表明该毒株是JXA1-like毒株;遗传进化分析结果表明,该毒株属于美洲型毒株,但是位于一个新的独立分支上,推测高致病性毒株可能出现了新的变异。以ZSBS-GD的序列为基础,设计出1对添加了酶切位点的特异性引物扩增Nsp10基因片段,连接在PET-28a上构建出原核表达载体PET-28a-Nsp10;将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测可在55KD左右出现目的蛋白;Western-blot验证显示该重组蛋白具有良好的免疫原性。经优化获得大量目的蛋白的条件为37℃、添加终浓度为1mmol/LIPTG以及诱导表达5h。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,按一定稀释度倍比稀释,并将实验室保存的PRRSV阴、阳性血清,按一定稀释度倍比稀释,优化各步骤的反应条件,成功建立了间接ELISA检测方法。优化后的条件为:重组蛋白包被抗原浓度为4.3μg/mL,37℃孵育2h或4℃过夜;封闭液为1%BSA,37℃封闭1.5h;血清1:200稀释,37℃作用1.5h;酶标二抗1:5000稀释,37℃作用1h;底物(TMB)室温显色20min;若检测的OD450>0.317,则为阳性;若检测的OD450<0.281,则为阴性。该方法与商品化的IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒符合率为92.4%,相对敏感性为93.1%,相对特异性为90.9%,统计学结果差异不显著,且满足了临床诊断的基本要求,为以后建立商品化的检测试剂盒奠定了基础。