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胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH,EC 3.5.1.24)是微生物生长、繁殖过程中产生的一种代谢物。胆盐水解酶是乳酸菌降胆固醇作用过程中的关键酶,该酶能水解结合态牛磺胆酸盐和甘氨胆酸盐,将其转变成氨基酸和游离胆酸。目前,很多BSH已经从各种微生物中得以纯化和鉴定,如乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、梭状芽孢杆菌、类杆菌和链球菌等。国内外大量临床试验证实,服用益生菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量,而降血清胆固醇与乳酸菌产生的BSH活力密切相关。本文对来源于植物乳杆菌JPP2染色体上的一段编码胆盐水解酶基因bsh3进行克隆测序分析,发现具有五个保守的胆盐水解酶氨基酸活性位点,分别为Cysteine(C)-2, Arginine(R)-18, Aspartic acid(D)-21, Asparagine(N)-175, Arginine(R)-228。与NCBI上同为植物乳杆菌属的五株菌进行比较,发现氨基酸序列同源性均达99%以上。利用中间克隆载体pMD19-T将其构建于表达载体pET-28b上,并转化入表达宿主菌E.coli BL21(DE3),成功构建重组BSH的工程菌。由于pET-28b载体携带T7强启动子,在IPTG诱导下,高效表达外源目的基因易导致包涵体的产生,收集菌体经高压均质仪破胞,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和相差显微镜观察,断定破胞不溶性物质中含包涵体。通过镍离子螯合柱成功分离纯化出重组的bsh3胆盐水解酶,纯化后的重组BSH条带单一,达到电泳纯。诱导重组表达载体并提取胞外粗酶液。运用高效液相色谱法检测其酶活力。对甘氨胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐三种结合胆盐进行酶促反应,酶活力分别为:30.75 U/mL,32.52 U/mL,28.91 U/mL。随着人们生活水平的逐步提高,动脉硬化、冠心病、心脑血管疾病、高血压疾病发病率逐年上升,严重影响人们的健康,而血清胆固醇水平过高则是引起上述系列疾病的主要因素之一。本研究的开展,对明确胆盐水解酶酶学性质,开发降胆固醇发酵乳制品具有重要的理论指导意义和实用价值。