【摘 要】
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甲型流感病毒易发生变异,曾多次引起世界性的大流行,目前针对于流感病毒药物较少,并且有限的抗病毒药物及其大量使用已经出现针对这些药物的耐药病毒株。抗体作为一种新型的抗流感病毒药物具有很好的抗病毒效果,然而传统的抗体由于分子量大,组织穿透力差,生产成本高,限制了其作为药物的有效性和广泛应用。因此,寻找稳定性好,亲和力强的天然小分子抗体成为抗体药物发展的新出路。基于实验室已有的鲨鱼纳米抗体平台,本课题利
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甲型流感病毒易发生变异,曾多次引起世界性的大流行,目前针对于流感病毒药物较少,并且有限的抗病毒药物及其大量使用已经出现针对这些药物的耐药病毒株。抗体作为一种新型的抗流感病毒药物具有很好的抗病毒效果,然而传统的抗体由于分子量大,组织穿透力差,生产成本高,限制了其作为药物的有效性和广泛应用。因此,寻找稳定性好,亲和力强的天然小分子抗体成为抗体药物发展的新出路。基于实验室已有的鲨鱼纳米抗体平台,本课题利用H1N1、H3N2、H5N6和H7N9四种流感病毒交叉免疫3条鲨鱼,获得高中和效价的抗流感病毒鲨鱼血清,其中中和H1N1、H3N2、H5N6和H7N9四种流感病毒的最高半抑制滴度分别达到2560倍,2560倍,640倍,160倍。我们选择多个高中和效价的血液样本,分别分离出PBMCs,提取RNA并反转录为c DNA,进一步利用噬菌体展示技术,成功构建库容达2×10~8,多样性达98.3%的噬菌体文库。广谱的中和抗体通常识别不同抗原的保守表位,因此我们分别采用单一抗原筛选和不同抗原交叉筛选的策略,以期获得广谱型的抗流感病毒鲨鱼纳米抗体。通过多轮的固相淘筛,我们用H1N1、H3N2、H5N6和H7N9四种灭活病毒抗原筛选获得80株鲨鱼纳米抗体序列,进一步将纳米抗体序列构建至原核表达载体,并将其转化至大肠杆菌Arctic表达菌,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）来诱导表达可溶性的鲨鱼纳米抗体。我们用SDS-PAGE检测到抗体均在菌体破碎上清中有不同程度的表达,同时利用ELISA方法检测破碎上清中纳米抗体的结合活性,初步筛选出79株与各自筛选抗原有结合的抗体,其中12株抗体与H1N1、H3N2、H5N6和H7N9四种灭活病毒抗原均有较好结合。将具备广谱结合活性的鲨鱼纳米抗体进行大量表达纯化,发现7株鲨鱼纳米抗体对7种流感病毒的EC50均低于10μg/m L,4株鲨鱼纳米抗体对7种流感病毒的EC50均低于5μg/m L。进一步的中和实验结果表明,2株鲨鱼纳米抗体对6种流感病毒的IC50均低于2μg/m L。本课题筛选获得多个具有广谱结合活性及中和活性的流感病毒鲨鱼纳米抗体,为研发预防和治疗流感病毒的抗体药物奠定了一定的基础。
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