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背景自古以来,结核分枝杆菌(MTB)作为一种具有极强传染性的微生物,引起的结核病一直威胁着人类以及许多其他动物的健康。据最新统计,全球新增约960万人/年感染活动性结核杆菌,有近150万人/年死于结核病及其相关并发症。在感染初早期快速且准确的检出结核杆菌及早开始治疗可大大降低结核在人群中的播散。作为近几年来快速发展的、可检测抗原特异度细胞免疫应答反应的新技术,ELISP OT已被证明可用于诊断结核的活动性与潜伏性感染。但基于该原理的诊断试剂鲜有新的改进。主要由于该检验方法的主要影响条件尚不够明确。全基因组表达谱芯片技术是近几年来逐步发展成熟的一种可以在同一时间检测大量基因的表达的新的检测方法,其具有高通量和高灵敏性的特性。当前主要的研究集中在ELISPOT是否可以正确快速的诊断不同人群、不同种类的结核,对于如何提高其诊断性能的研究较少。目的验证重组特异性蛋白ESAT-6及CFP-10的生物活性,建立具有较高灵敏度和特异性的ELISPOT方法。以基因芯片为基础,通过生物信息结果分析探讨影响结核特异性蛋白ESAT-6及CFP-10作用于特异性T淋巴细胞的主要机制。方法以聚合酶链反应(PCR)扩增CFP-10及ESAT-6基因片段,构建原核表达重组质粒。重组质粒转化后,经IPTG诱导表达后通过亲和层析法纯化CFP10和ESAT6重组蛋白,分别分析其蛋白纯度。通过条件梯度的摸索建立可应用于临床的ELISPOT方法确定适合的ELISPOT方法实验条件。通过磁珠分选技术分选出CD4阳性的淋巴细胞,选取合适的表达谱基因芯片,筛选出蛋白刺激前后显著差异表达的基因位点,根据GO分析及KEGG分析,预测其对应的通路。为今后的实验建立起对应的结构布局。结果1.本实验室现已构建稳定的特异性蛋白表达体系,根据实验条件建立了ELISOPT技术检测结核杆菌感染的一系列实验步骤。2.与T-Spot试剂盒进行对比,ELISPOT的特异度与灵敏度分别为82.35%和88.50%(χ2=0.57,P>0.05),差异无统计学意义。3.通过芯片检测刺激前后结核病人T细胞的差异位点,CFP-10刺激后表达上升相对应基因参与BP的GO条目共1138条,参与CC的GO条目共31条,参与MF的GO条目共59条;表达下降相对应基因参与BP条目共1273条,参与CC条目共154条,参与MF条目共181条。ESAT-6刺激后表达上升相对应基因参与BP的GO条目共1295条,参与CC的GO条目共112条,参与MF的GO条目共71条;表达下降相对应基因参与BP条目共1089条,参与CC条目共112条,参与MF条目共139条。4.联合KEGG与差异表达基因的分析,上升和下降的通路中,CFP-10组与结核及IFN-γ相关的信号通路如下细胞因子受体相互作用、Toll样受体、JAK-STAT、细胞粘附等;ESAT-6组与结核及IFN-γ相关的信号通路如下JAK-STAT、Toll样受体、NF-κB、PI3K-Akt等。结论本研究结果显示本实验室建立的ELISPOT具有较好的灵敏度和特异性,可基本进行临床标本的筛查,降低了检测成本。通过基因芯片结果分析,可筛选出差异性较高的基因位点,且与IFN-γ分泌及结核感染多存在一定的相关性,为后续机制的研究明确了方向。