论文部分内容阅读
番茄是重要的蔬菜作物,植株光合效率对番茄的产量及品质有着极其重要的影响,而叶片是其光合积累有机物的场所。叶色突变是比较常见并容易观察表型的一类突变体,该类突变体的形成是由于叶绿素含量、叶绿体发育以及光合作用等过程受到影响导致,从而影响作物品质或产量。本研究以在遗传转化过程发现的一株番茄杂色叶突变体vg为研究对象,通过从生理、遗传、及分子水平对突变体进行表型鉴定、突变原因、遗传分析、基因定位、功能验证等研究,了解vg突变体杂色叶产生的机制,为研究番茄光合途径及效率提供理论基础。主要的研究结果如下:1.番茄叶色突变体vg的表型:vg突变体表现为苗期正常,在播种后一个月左右开始出现叶色变化,首先是刚成熟的叶片出现部分泛白,随着幼苗生长有泛白的叶片增多,并且出现包括生长点的幼叶出现黄化,植株长势受到抑制。秋季育苗高温强光照条件下,表型更加明显,生长势更弱。2.番茄叶色突变体vg的生理特性分析:观察叶绿体的超微结构发现与AC相比,vg突变体黄化叶片的叶绿体形态异常,没有类囊体片层形成;vg突变体泛白叶片和正常绿色叶片的叶绿体形态基本正常,但泛白叶片叶绿体的类囊体片层的排列分散、类囊体基粒较少;正常绿色叶片叶绿体的类囊体片层排列不紧密。且在vg突变体的叶片中,没有明显可见的淀粉粒形成。分别测定三种叶色的叶绿素含量发现,黄化叶片的叶绿素a、叶绿素b都显著降低,泛白叶片的叶绿素b降低,正常绿色叶片的叶绿素含量基本不变。且正常绿色叶片的可溶性糖含量以及淀粉含量都明显减少。3.番茄叶色突变体vg的共分离及遗传分析表明:vg突变体的表型与转入的基因没有关系,且不是T-DNA插入导致的突变,而是遗传转化过程引起的突变。以LA1589为母本,vg突变体为父本构建F2遗传分离群体,分析表明vg突变体的突变表型是单核基因控制的隐性性状。4.利用分离群体基因定位:从F2群体分离的45株有突变表型的单株,以及在每条染色体上开发并筛选出具有稳定多态性的2个In Del标记,将目的基因定位在第7条染色体。进一步开发筛选了15对In Del分子标记,结果将目的基因定位在7-59980和7-60636两个标记之间物理距离为756 kb的区段。扩大分离F2群体,分离出了182株有突变表型的单株用于精细定位,利用1个In Del和8个CAPS分子标记,将目的基因定位在s6027和Ba6040两个标记之间物理距离为128 kb的区段。5.基因侯选:利用预测网站和基因序列分析,分析可知在目的区段有21个开放阅读框（ORFs）。其中ORF10、ORF11、ORF12和ORF13与叶绿体发育或叶绿素合成相关,而已有研究表明ORF10的同源基因在拟南芥中导致类囊体形成受到阻碍。在突变体和AC中扩增4个基因的编码序列以及ORF10的启动子序列,均未发现碱基序列上的差异。6.基因时空表达分析:利用q RT-PCR分析除伤诱导相关基因外的12个基因在AC和突变体中的表达量。结果显示ORF9、ORF10和ORF13的表达量显著降低,ORF11的表达量表现显著升高。而ORF9在ORF10的启动子上,ORF10编码类囊体形成蛋白。因此,推测ORF10可能是导致突变表型的目的基因。7.利用VIGS技术验证候选基因功能:构建了ORF10和ORF13的p TRV2病毒表达载体,以AC为浸染受体。结果显示,AC沉默ORF13不会产生突变表型,沉默ORF10使AC表现与突变表型相似的表型。因此,确定ORF10是导致突变表型的目的基因。