视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一种严重的致盲性疾病,人们对该病的治疗进行了各种尝试,包括视网膜移植、基因治疗、视觉假体、药物干预等,但至今尚无确切有效、能重建视功能的治疗方法,究其根本原因在于视网膜变性的病理机制极为复杂,在感光细胞丧失之后内层神经元也发生继发变性,因此视功能的维持和重建存在巨大的障碍。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)以动作电位的方式将视觉信息编码、整合,然后投射至高级视觉中枢,因此节细胞的功能状态决定着视觉信息的最终输出。感光神经节细胞(intrinsically photosensitive RGCs, ipRGCs)是RGCs中含有特殊感光色素melanopsin的一小类细胞(因此也叫melanopsin-containing RGCs, mRGCs),它不需要接受来自视锥视杆的信息输入而直接感光。有学者发现在慢性高眼压状态下ipRGCs较普通RGCs更能抵抗压力的影响而存留,在视网膜变性过程中mRGCs如何变化未见报道。mRGCs与RGCs相比不需要接受来自视锥视杆的信息输入,而所在的视网膜层次、视网膜微环境完全相同,因此对mRGCs在视网膜色素变性过程中形态和功能深入研究,对比RGCs的形态和功能特性,将对揭示RGCs继发变性提供极为重要的线索,也为视网膜变性之后神经元的保护和功能重建提供新的思路。本实验室采用视网膜色素变性的经典动物模型RCS大鼠,在前期的研究中发现变性晚期RGCs数量显著减少,进一步功能研究发现变性RGCs被动膜学特性和动作电位的发放类型、发放频率等也发生改变,部分RGCs甚至失去动作电位的发放。提示在感光细胞变性死亡之后,RGCs在数量和功能上也发生了明显的变性。然而RGCs继发变性死亡的触发机制至今尚不清楚。视网膜神经元胞膜上各种离子通道的表达、电流密度和动力学特性,动作电位的类型、发放频率和幅度,以及神经递质和受体的分布及功能状况共同决定了视网膜神经元的存活或死亡,以及视觉信息的传递。因此研究RCS大鼠视网膜变性过程中RGCs通道特性将对理解其膜学特性改变的分子蛋白基础提供依据。本研究的目的是通过对RCS大鼠视网膜变性过程中mRGCs和RGCs形态、膜特性、通道电流和钙流变化的研究,结合本课题组和既往其他学者的研究结果,对视网膜变性的病理机制有更深入的了解,为未来视网膜变性中神经元的保护、功能的重建提供线索;建立大鼠逆行标记RGCs和mRGCs并在荧光显微镜下对视网膜组织切片上不同类型细胞分类进行膜片钳全细胞记录技术,为未来视网膜细胞和组织、神经网络等进行深入探讨,从而为揭示视觉功能的本质和变性的病理机制建立平台。本研究采用视网膜铺片和切片免疫荧光染色、视交叉上核(SCN) Fluorogold逆行标记,研究了视网膜变性过程中mRGCs在视网膜中的分布情况、形态学特征和数量变化;采用westernblot检测melanopsin蛋白在视网膜变性过程中的表达情况;采用视网膜切片膜片钳,研究变性过程中RGCs钠钾离子电流幅值、密度、I-V曲线等动力学特性;采用免疫组织化学染色和westernblot研究电压依赖性钠通道蛋白在变性过程中的表达变化;运用钙成像技术探讨RGCs在变性过程中胞内钙的强度变化;在立体定位下行SCN逆行标记感光神经节细胞,在荧光显微镜下对mRGCs行膜片钳全细胞记录,研究mRGCs的电生理学特性,并与对照大鼠进行比较。本课题在以下方面进行较为深入的研究后得到如下结果和结论:第一部分RCS大鼠视网膜变性过程中mRGCs的分布、形态、数量和melanopsin蛋白的表达感光神经节细胞mRGCs是近年来发现的视网膜内一种特殊的神经元,它含有一种特殊的感光色素melanopsin,不需要视锥视杆的输入而直接感光。那么在视网膜变性过程中,mRGCs的分布、形态学特征和数量发生了怎样的改变?melanopsin蛋白的表达如何变化?与RGCs变化的关系如何?本研究采用视网膜铺片和切片免疫荧光染色、视交叉上核(SCN) Fluorogold逆行标记方法,研究视网膜变性过程中mRGCs在视网膜中的分布情况、形态学特征和数量变化;采用westernblot检测melanopsin蛋白在视网膜变性过程中的表达情况。结果发现:1、成功完成在上丘和外膝体逆行Fluorogold对RGCs的标记,以及视交叉上核SCN对mRGCs的逆行标记;逆行标记的mRGCs和RGCs在视网膜变性过程中数量、分布和比例的改变与免疫荧光染色结果一致,表明两种方法确实可信。2、视网膜铺片和切片免疫荧光染色结果发现mRGCs散在分布于RCS大鼠和对照大鼠视网膜各区域,颞侧相对分布较多,但在上、下、鼻、颞四个象限的分布无显著差异;melanopsin不仅表达于mRGCs的胞膜和胞浆,也表达于树突和轴突,且变性晚期突起上melanopsin染色增强;mRGCs形态上类似于α神经节细胞,其树突伸向内丛状层(IPL)和内核层(INL),但未见与其它神经元构成紧密联系。3、在RCS大鼠变性过程中视网膜神经节细胞层的数量显著减少,而mRGCs的数量无明显减少,mRGCs与RGCs的比例在变性晚期反而增高。4、Westernblot检测发现melanopsin分子量在60kd左右,变性晚期melanopsin蛋白的表达显著升高。提示在RCS大鼠视网膜变性过程中与RGCs相比mRGCs似乎存在一种能耐受变性的影响而得以保留的特质,进一步的研究寻找其耐受变性的原因,可为未来视网膜变性疾病中神经元的保护、视功能的重建提供实验室依据。第二部分RCS大鼠视网膜变性过程中RGCs钠钾通道特性和胞内钙变化RCS大鼠视网膜神经节细胞在感光细胞变性死亡之后数量显著减少,前期研究发现变性晚期相当部分的神经节细胞失去动作电位的发放功能。为了回答导致神经节细胞失去发放功能的分子蛋白基础是什么,神经节细胞胞膜上的离子通道蛋白发生了什么样的改变,通道电流特性如何,本课题采用视网膜切片膜片钳全细胞记录研究变性过程中RGCs钠钾离子电流幅值、密度、I-V曲线等动力学特性;采用免疫组织化学染色和westernblot研究电压依赖性钠通道蛋白在变性过程的表达变化;运用钙成像技术探讨RGCs在变性过程中胞内钙的浓度变化。结果发现:1、在视网膜切片上成功完成RGCs的全细胞记录,结合阻断剂成功记录到内向的钠电流和外向的钾电流,发现RCS大鼠变性晚期钠离子电流显著受损,需要在较高的钳制电压下才能诱发出微弱的电流,相对钾电流受损较轻。钠通道蛋白免疫荧光染色和Westernblot检测显示变性晚期钠通道蛋白明显受损或减少。2、在变性晚期RGCs被动膜学特性(RMP、IR、Cm等)发生改变,在P60d时约27.3%(6/22),P90d时66.7%(12/18)的RGCs不能诱发出动作电位。3、RGCs钙成像显示变性晚期RGCs胞内呈钙超载。以上结果提示:RCS大鼠变性晚期RGCs钠离子电流显著降低,通道蛋白表达下降,是RGCs失去动作电位发放的最直接原因;钾电流改变轻微,保证了RCS大鼠变性后期RGCs的基本生理状态的维持和存活;胞内钙超载激活一系列胞内效应酶,最终引起神经元损伤或死亡,是RGCs死亡或失能的始动机制。然而引起视网膜变性过程中RGCs胞内钙浓度增加、激活一系列生化反应链以及信息传导通路,引发膜通道蛋白、膜受体等的改变,最终导致神经元失能甚至死亡的病理机制,尚待进一步深入研究。而感光神经节细胞mRGCs的数量在变性晚期不仅没有减少,与RGCs的比例反而增高,那么mRGCs在视网膜变性过程中电生理功能如何,是下一步的研究内容。第三部分RCS大鼠视网膜变性过程中mRGCs电生理学特性在立体定位下成功完成Fluorogold SCN逆行标记mRGCs,并在荧光显微镜下完成全细胞记录,研究mRGCs的电生理学特性,并与对照大鼠进行比较。结果显示:1、建立和完善了SCN逆行标记mRGCs并在荧光显微镜下行mRGCs膜片钳全细胞记录技术。2、发现视网膜变性过程中mRGCs的膜学特性(包括RMP、IR、Cm等)无显著改变。3、RCS大鼠mRGCs动作电位以瞬变型为主,其发放频率、幅度与对照大鼠相比无显著差异。4、成功记录到mRGCs钠钾离子电流,RCS大鼠视网膜变性过程中mRGCs动力学特性与对照大鼠相似,未发现明显改变。5、成功行mRGCs细胞内染色,其形态学特性与正常大鼠相比无显著差异。在一例mRGCs细胞内染色中发现与RGCs存在染色耦合,两者之间是否存在信息交流有待进一步研究。以上结果提示:成功建立大鼠逆行标记RGCs和mRGCs并在荧光显微镜下对视网膜组织切片上不同细胞类型分类进行膜片钳全细胞记录,为未来视网膜细胞和组织、神经网络等进行深入探讨,从而为揭示视觉功能的本质和变性的病理机制建立平台;对mRGCs的膜学特性和膜通道特性进行了深入研究,尤其对视网膜变性过程中mRGCs的功能特性进行了较为详尽的探讨,为视网膜变性机制研究奠定基础;对于视网膜变性过程中RGCs的变性死亡和mRGCs的形态和功能存留做了初步探索,为神经元的保护、视网膜变性功能重建提供线索;mRGCs与RGCs之间存在染色耦合现象,但两者之间究竟是否存在信息的交流,对视觉信息或非图像视觉系统具有什么样的意义,有待进一步研究。