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小麦叶锈菌引起的叶锈病是小麦上最为常见的病害之一,发病严重时可对小麦产量产生巨大影响。筛选高效抗病基因,并明确其抗病机制是控制小麦叶锈病的重要手段。植物体中存在着的富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinases,LRR-RLKs)对植物生长发育及抗病反应有重要作用,然而该类基因的功能在小麦中的研究报道还相对匮乏。本试验基于实验室近期获得的RNA-Seq数据库,筛选得到1个在接种叶锈菌后相对表达量显著变化的属于LRR-RLKs的Unigene。利用同源克隆技术在小麦(Triticum aestivum L.)品种TcLr26中获得其同源基因,根据该基因的系统进化树,命名为TaEFR1。本试验以小麦近等基因系TcLr26和Thatcher分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和与亲和组合,在不亲和组合中表现典型的细胞过敏性死亡(Hypersensitive reaction,HR)现象。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对TaEFR1基因接菌后不同时间点的相对表达量进行了分析;通过VIGS(Virus induced gene silencing,VIGS)技术在TcLr26中降低其转录水平表达,初步推测了TaEFR1基因可能参与小麦抵抗叶锈菌的抗病反应。所得主要结果如下: 1.基于RNA-Seq数据库,筛选得到1个在接种叶锈菌后较0h相对表达量明显变化的属于LRR-RLKs的Unigene,从小麦TcLr26中同源克隆获得其同源基因的CDS全长。生物信息学分析该基因编码蛋白为913个氨基酸,其蛋白结构包含1个信号肽,胞外存在9个LRRs结构域,1个跨膜区和1个胞内丝/苏氨酸激酶域。 2.利用RT-qPCR检测接种叶锈菌后TaEFR1基因的转录水平表达模式,结果表明,接种叶锈菌后早期,不亲和组合中该基因被诱导表达,于8h达到峰值,然后基因表达量下降,在接菌后24h该基因再次被诱导表达,且其表达量出现回升趋势;而亲和组合中变化趋势与不亲和组合相似,但表达量远远低于不亲和组合,初步证明TaEFR1基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的过程。 3.通过VIGS技术,在TcLr26中沉默TaEFR1基因,接种叶锈菌生理小种260后,发现HR面积扩大,HMC数量增多,意味着沉默TaEFR1基因后小麦对叶锈菌的抗性降低,叶锈菌更容易侵染寄主细胞。上述结果表明TaEFR1基因在小麦抵抗叶锈菌侵染诱发的防卫反应中,起到重要的正调控作用。 4.构建TaEFR1基因的亚细胞定位载体使TaEFR1与GFP蛋白融合表达,发现TaEFR1蛋白在细胞膜系统上表达,且主要在质膜和核膜上表达。 5.小麦TcLr26外源喷施SA后,TaEFR1基因被诱导表达,揭示TaEFR1基因可能参与了SA信号通路,并在SA信号下游发挥作用。 6.对小麦TcLr26叶片预注射EGTA,再接种叶锈菌生理小种260,RT-qPCR结果显示,TaEFR1基因的表达水平被EGTA强烈抑制,表明该基因参与了Ca2+信号通路,并在Ca2+下游发挥作用。 7.不同近等基因系小麦品种接种叶锈菌生理小种260后,在三个不亲和组合中(TcLr1、TcLr19和TcLr21接种叶锈菌),TaEFR1基因的表达模式不同。对于TcLr1和TcLr21来说,该基因参与了基础防卫反应PTI的诱发,同时可能也介导了抗叶锈基因Lr1或Lr21诱发的防卫反应。在TcLr19形成的不亲和组合中,该基因参与了基础防卫反应PTI的诱发,但在抗叶锈基因Lr19诱发的防卫反应中没有发挥主要作用。而在亲和组合(TcLr10接种叶锈菌)中,TaEFR1基因仅参与了小麦抵抗叶锈菌侵染过程中基础防卫反应PTI的诱发,并发挥正调控作用。上述结果表明,该基因在不同的Lr基因背景下所发挥的作用是不同的。 8.成功构建了PCM1307-3FLAG-3HA-TaEFR1植物表达载体,瞬时转化小麦TcLr26,Western Blot结果表明,TaEFR1蛋白在TcLr26中进行了瞬时表达。