刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷人群感染后可引起严重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形虫急性感染阶段引起机体产生免疫反应的主要抗原，NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型，其中NTPase-Ⅰ仅存在于有毒株，而NTPase-Ⅱ存在于所有弓形虫株体内[12]，因此NTPase-Ⅱ可用于检测候选抗原和候选的保护性抗原。本研究将对弓形虫NTPase-Ⅱ基因进行原核表达，探讨NTPase-Ⅱ原核表达蛋白在弓形虫病早期诊断的应用，并制备其单克隆抗体，研究单抗对弓形虫的抑制作用。此外，并构建弓形虫NTPase-Ⅱ基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的研制奠定基础。 目的： 1.诱导表达弓形虫融合蛋白NTPase-Ⅱ，建立检测小鼠血清中刚地弓形虫NTPase-Ⅱ特异性IgG、IgM抗体的间接ELISA法，探讨用于弓形虫感染早期检测的应用价值。 2.制备、鉴定抗弓形虫融合蛋白NTPase-Ⅱ单克隆抗体，通过体外、体内实验探讨单克隆抗体对弓形虫的抑制作用。 3.构建弓形虫NTPase-Ⅱ基因真核表达载体，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定基础。 方法： 1.NTPase-Ⅱ基因的原核表达 用含重组表达质粒NTPase-Ⅱ-pBAD-HisB的E.coli BL21(DE3)在一定条件下在诱导剂L-阿拉伯糖的作用下进行诱导表达。 2.重组NTPase-Ⅱ融合蛋白的纯化及鉴定 使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组融合蛋白，SDS-PAGE鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，紫外分光光度计测定其浓度。 3.间接ELISA检测弓形虫感染鼠NTPase-Ⅱ抗体 以刚地弓形虫NTPase-Ⅱ融合蛋白为包被抗原建立间接ELISA法，动态检测刚地弓形虫实验感染鼠血清NTPase-Ⅱ特异性IgG、IgM抗体变化，试验设脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清对照。 4.单克隆抗体的制备及应用 用融合蛋白NTPase-Ⅱ作为抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，每次间隔2周，末次免疫后3d取小鼠脾细胞及Sp2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合，有限稀释法筛选出高滴度分泌McAb的杂交瘤细胞株，蛋白质印迹(Western blotting)及ELISA分析其特异性，试剂盒测定其免疫球蛋白亚类，初步探讨其在弓形虫诊断及治疗中的应用。 5.NTPase-Ⅱ基因真核表达载体的构建 采用PCR方法扩增刚地弓形虫RH株的NTPase-Ⅱ基因，克隆入pGEM-T easy载体，阳性克隆经酶切与测序鉴定后亚克隆至真核表达质粒PVAX1。 结果： 1.SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经Nj2+-NTA树脂纯化后纯度约为84％。 2.小鼠血清中的抗NTPase-Ⅱ抗体IgM于弓形虫感染后第3d开始出现阳性反应，IgG抗体于感染后第7d开始出现阳性反应，脑囊虫病、血吸虫病及肺吸虫病病人血清特异性IgG阳性率分别为0、1.92％和0。 3.经筛选获得能稳定分泌抗弓形虫融合蛋白NTPase-Ⅱ单克隆抗体2株和杂交瘤细胞2株，分别命名为为MNT1和MNT2； Western blotting显示2株单克隆抗体均能与弓形虫重组融合蛋白NTPase-Ⅱ发生特异性结合，ELISA结果显示2株单克隆抗体均能与弓形虫速殖子全虫蛋白及弓形虫重组融合蛋白NTPase-Ⅱ发生特异性结合；2株单克隆抗体经免疫球蛋白类和亚类鉴定均为IgG2a；免疫保护实验表明2株单克隆抗体无法阻止弓形虫入侵宿主细胞，但却可抑制弓形虫在宿主细胞内增殖；动物保护实验证实2株单抗都有一定的保护作用；免疫荧光定位结果显示2株单克隆抗体与弓形虫的结合部位主要是在弓形虫膜表面。 4.PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，成功构建了真核表达载体PVAX1-NTPase，经测序鉴定亚克隆的NTPase-Ⅱ基因序列与Genebank公布的序列同源性为100％。 结论： 1.本实验成功表达了弓形虫NTPase-Ⅱ融合蛋白，间接ELISA检测弓形虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性较高，有望应用于弓形虫感染的早期检测。 2.制备的抗弓形虫融合蛋白NTPase-Ⅱ杂交瘤细胞株能分泌识别融合蛋白NTPase-Ⅱ的高特异性单克隆抗体，对单克隆抗体的初步应用显示其对弓形虫在宿主细胞内的繁殖具有一定的抑制作用，采用该单抗进行被动免疫具有一定保护效果。 3.成功构建了真核表达质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ，为弓形虫核酸疫苗的制备奠定