第一部分:恶性黑素瘤VEGF和eNOS的表达及其与肿瘤血管生成的关系 目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在恶性黑素瘤组织中的表达，以及与恶性黑素瘤血管生成的关系，探讨eNOS产生的一氧化氮(NO)在介导VEGF促肿瘤血管生成中的作用机制。 方法:应用免疫组织化学方法检测31例恶性黑素瘤组织eNOS、VEGF和血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)的表达，依据FⅧRAg的表达评价肿瘤微血管密度(MVD)，并且以30例色素痣组织作为对照研究。 结果:①在31例恶性黑素瘤组织中，24例表达eNOS，26例表达VEGF，而在色素痣组织未检测到eNOS和VEGF的表达；②在恶性黑素瘤组织中，VEGF与eNOS的表达呈正相关；③在恶性黑素瘤组织中，eNOS、VEGF的表达与MVD呈正相关，且恶性黑素瘤MVD明显高于色素痣；④在恶性黑素瘤组织中eNOS、VEGF表达与淋巴结转移无关。 结论:①VEGF和eNOS可作为区别良、恶性黑素细胞肿瘤的重要指标；②在恶性黑素瘤中MVD随着VEGF和eNOS表达的增强而增加，提示两者可促进恶性黑素瘤血管生成；③eNOS在VEGF调节肿瘤血管生成中可能具有重要作用。 第二部分:VEGF的表达对恶性黑素瘤细胞增殖的影响及其机制 目的:观察VEGF表达对恶性黑素瘤细胞增殖的影响，以及一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)在其中所起的作用，以探讨VEGF促进恶性黑素瘤细胞增殖的作用机制。 方法:通过电穿孔法将VEGF165cDNA和空载体分别转染至恶性黑素瘤细胞系A375中，并设未转染细胞作为对照。采用细胞计数法和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测上述处理的A375细胞体外增殖效应及其分泌的VEGF含量，蛋白印迹(WesternBlot)实验检测上述处理细胞合成的诱导型、内皮型、神经型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的蛋白表达，用硝酸还原酶法检测上述处理细胞培养上清中NO含量，MTT法检测一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对转染VEGF165cDNA后A375细胞的增殖影响。 结果:与对照组相比，转染VEGFi65cDNA的A375细胞的增殖能力明显增强(P＜0.05)，转染后72h、96h其VEGF的分泌明显增加(P＜0.01)，转染后48h、72h、96h其iNOS蛋白的合成和NO的释放明显升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，但在实验组和对照组中均未检测到eNOS和nNOS蛋白表达，L-NAME对转染VEGF165cDNA72h后的A375细胞增殖具有抑制作用，并显示剂量依赖性(P＜O.01)。 结论:内源性VEGF可能通过自分泌方式促进A375细胞增殖，其促进A375细胞增殖作用可能与iNOS产生的NO密切相关。 第三部分:pU-VEGF-siRNA表达载体的构建及鉴定 目的:构建针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA，并导入恶性黑素瘤细胞，探讨其在体外培养恶性黑素瘤细胞中对VEGF的干扰作用。 方法:人工合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链，将其插入到pSilencerTM2.1-U6neo载体中，经测序鉴定所构建的重组体是否正确；采用电转染方法将构建重组体导入人恶性黑素瘤细胞系A375和人结直肠癌细胞系LOVO细胞中，用G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、ELISA分别检测转染细胞VEGFmRNA和蛋白的表达变化。结果经测序证明pU-VEGF-siRNA序列正确；G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞；转染pU-VEGF-siRNA载体后，A375和LOVO细胞VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P＜O.01)。 结论:L测序结果表明发卡样的VEGF-siRNA真核表达载体构建成功，转染A375和LOVO细胞后获得稳定表达，并可特异性封闭VEGF的表达，为进一步研究pU-VEGF-siRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础。 第四部分:pU-VEGF-siRNA对恶性黑素瘤细胞生物学行为影响的实验研究 目的:研究pU-VEGF-siRNA体外对A375和LOVO细胞的增殖和凋亡，及其体内对恶性黑素瘤成瘤和凋亡的影响，以期为临床恶性黑素瘤的治疗提供理论依据和实验数据。 方法:采用细胞计数法检测实验组和对照组A375和LOVO细胞增殖，并将含实验组和对照组A375细胞培养上清的培养液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304)，观察ECV-304生长情况；用流式细胞术(FCM)检测转染pU-VEGF-siRNA载体的A375细胞凋亡；应用免疫组织化学方法检测裸鼠肿瘤组织VEGF和血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)的表达，依据FⅧRAg的表达评价肿瘤微血管密度(MVD)；末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)定量检测pU-VEGF-siRNA转染细胞裸鼠模型的肿瘤组织凋亡。 结果:实验组A375细胞增殖较对照组明显减慢(P＜0.01)，其细胞周期出现亚二倍体凋亡峰，而LOVO细胞的增殖与对照组比较无明显差异(P＞0.05)，对照组A375细胞培养上清对ECV-304细胞的增殖具有明显的促进作用，而实验组A375细胞培养上清对其促增殖作用显著降低(P＜0.01)；体内实验证明，实验组成瘤率显著低于对照组(P＜0.05)，且其肿瘤生长速度也明显减慢(P＜0.01)，实验组VEGF表达和MVD明显低于对照组(P＜0.01)，实验组可见大量凋亡细胞，对照组仅见少许凋亡细胞，实验组凋亡指数与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。 结论:通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达，不仅在体外可抑制A375和ECV-304细胞增殖，诱导A375细胞凋亡，而且在体内可显著性抑制恶性黑素瘤生长，为恶性黑素瘤基因治疗研究提供了实验依据。