脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是单股正链无囊膜的小RNA病毒,人和动物感染后可引起脑炎、心肌炎以及神经系统疾病和生殖障碍等,是重要的人畜共患病原体,对人类健康具有重要的公共卫生学意义。病毒入侵宿主时可通过多种方式和策略逃避宿主的天然免疫应答机制,很多病毒利用自身编码的不同蛋白拮抗或抑制宿主天然免疫过程,从而实现病毒在宿主细胞内的有效增殖。本研究前期通过实时荧光定量PCR技术筛选了能够显著促进EMCV体外增殖的结构蛋白VP2,为探明VP2促进EMCV体外增殖的作用机制,进一步深入研究了VP2在IFN-β产生及RLRs信号通路中的调控作用。通过免疫印迹、免疫共沉淀及激光共聚焦等实验筛选并验证受VP2蛋白调控的RLRs信号通路的作用靶分子以及VP2抑制RLRs信号通路的可能作用机理。本研究获得以下研究结果:1.EMCV结构蛋白VP1、VP2和VP3均可显著促进EMCV体外增殖,其中VP2蛋白对病毒的增殖效果最明显。此外,VP2促进EMCV体外增殖与RLRs信号通路活化和IFN-β产生密切相关。2.结构蛋白VP2以剂量依赖方式显著抑制EMCV、Poly(I:C)及通路关键蛋白介导的IFN-β产生及RLRs信号通路蛋白的表达。此外,VP2显著抑制IRF3和STAT1的磷酸化水平和核转移水平,表明VP2通过抑制RLRs信号通路减少IFN-β产生。3.激光共聚焦和免疫共沉淀实验结果表明脑心肌炎病毒结构蛋白VP2和RLRs信号通路关键蛋白MDA5、MAVS和TBK1共定位在胞质,且存在特异性相互作用。4.蛋白酶体途径抑制剂MG132可明显减少VP2蛋白对MDA5、MAVS、TBK1和IRF3蛋白的靶向抑制作用,这表明VP2可利用或促进蛋白酶体途径靶向降解MDA5、MAVS、TBK1和IRF3的表达及抑制RLRs信号通路激活。综上结果表明,本研究首次证实脑心肌炎病毒结构蛋白VP2通过下调RLRs信号通路关键蛋白MDA5、MAVS、TBK1和IRF3的表达及与MDA5、MAVS和TBK1相互作用显著抑制IFN-β产生和RLRs信号通路活化。此外,VP2蛋白还通过蛋白酶体途径靶向降解MDA5、MAVS、TBK1和IRF3蛋白的表达,最终通过减少RLRs信号通路产生IFN-β达到促进病毒增殖的目的。这些结果对进一步阐明EMCV结构蛋白介导的天然免疫机制奠定了基础,为深入阐明EMCV感染致病机制提供重要信息,同时也为预防和控制EMCV感染提供了新思路。