研究背景及目的碳青霉烯类抗生素在临床上主要用于治疗革兰阴性菌导致的感染,因其对β-内酰胺酶高度的稳定性常用于治疗产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBLs)菌株引起的感染,但是由于近几年碳青霉烯类抗生素的大量使用及不规范使用,导致耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)临床分离阳性率逐渐上升,尤其是耐碳青酶烯类肺炎克雷伯杆菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP),不仅给临床抗生素有效治疗带来巨大挑战,还有潜在导致医疗机构耐药菌大爆发的风险。肠道是各种细菌的储存库,包括具有多重耐药性的细菌。近几年也有报道从人类粪便中分离出携带一种或多种碳青霉烯酶基因的CRE,甚至是携带多粘菌素耐药基因的耐药菌。CRE定植在正常人肠道中,如果宿主发生感染,极有可能会导致抗生素治疗失败导致最后无有效抗生素可以使用,这将会大大增加患者感染死亡率。另外,人体肠道也可以作为各种耐药菌和耐药基因的来源,对耐药菌和耐药性的广泛传播有重要作用。本研究主要通过比较临床来源CRE和粪便来源CRE的分子特征,分析临床CRE与粪便CRE之间的联系,为CRE感染预防和控制的提供更多依据。研究方法1.样本的收集 收集我院2016年7月至2019年6月送检的各类临床感染样本中分离的CRE;收集我院2016年7月至2019年6月2000例住院患者入院粪便常规检查的剩余粪便样本作为粪便调查标本,接种于终浓度2mg/L美罗培南的麦康凯培养基,筛选对碳青霉烯类抗生素美罗培南不敏感的革兰阴性杆菌。2.菌株种属鉴定及药敏实验 BD phoenix 100进行菌株种属鉴定及药物敏感性试验,筛选出最终确认为临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE菌株。对所有筛选的CRE菌株行E-test的替加环素药敏实验。3.PCR检测常见碳青霉烯酶基因 PCR检测临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE中常见碳青霉烯酶基因blaKPC.blaNDM.blaVIM、blaIMP、blaSPM和blaOXA-48,将阳性PCR产物进行测序确认。4.PCR检测常见ESBLs基因 PCR检测临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE中常见ESBL基因blaCTX-M.blarEM和blaSHV,将阳性PCR产物进行测序确认。5.PCR检测多粘菌素耐药基因 PCR检测临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE中多粘菌素耐药基因mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5,将阳性PCR产物进行测序确认。6.PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子及基因盒 检测临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因,筛选出携带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子的菌株,再进一步扩增其可变区,进行RFLP分析后测序分析。7.PCR检测ISCR及其基因盒 检测临床感染标本及粪便调查标本中分离的CRE中ISCR1基因,筛选出携带ISCR1基因的菌株,再进一步扩增其可变区,进行RFLP分析后测序分析。8.质粒接合转移试验 筛选需要进行质粒接合试验的菌株,以EJ53为受体菌进行供体菌与受体菌的质粒接合转移,接种于含有4μg/mL的美罗培南筛查平板,对可疑阳性接合子行药敏试验及耐药基因的检测。9.ERIC-PCR 对临床CRE和粪便CRE中检出率最高的三个菌种进行ERIC-PCR基因分型及电泳图谱聚类分析,研究菌株之间克隆相关性。10.全基因组测序及基因组学分析 从临床CRE和粪便CRE中各选取1株代表菌株进行全基因组测序,并针对测序结果进行基因组学分析。研究结果1.样本的收集 临床感染样本中分离99株CRE,主要来自血液科(37.4%)和重症医学科(22.2%);2000份粪便调查标本中最终筛选出30株CRE。2.菌株种属鉴定及药敏实验 CRKP是临床标本和粪便标本中分离阳性率最高的菌株,占所有CRE的66.7%,其次是阴沟肠杆菌(17.1%),和大肠埃希菌(8.5%)。大部分菌株对β-内酰胺酶类抗生素均耐药;而几乎所有CRE菌株对替加环素和多粘菌素高度敏感。3.CRE中常见碳青霉烯酶基因 在129株CRE中,携带碳青霉烯酶基因的CRE菌株占97.8%,其中在临床CRE和粪便CRE中blaKPC-2均是主要检测的碳青霉烯酶基因占93.8%,其次是blaNDM为52.7%,blaSPM和blaOXA-48未检测出。4.CRE中常见ESBLs基因 所有CRE菌株中携带ESBL基因的菌株占96.9%。临床CRE中blaCTX-M、blaTEM和blaSHV分别占24.2%、78.8%和87.9%;粪便CRE中blaCTX-M、blaTEM和blaSHM分别占 30.0%、90.0%和 86.7%。5.CRE中多粘菌素耐药基因 粪便CRE中检测出两菌株mcr-1阳性,mcr-2、mcr-3、mcr-4 和 mcr-5 未检测出。6.CRE中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子及基因盒 在所有CRE中检测Ⅰ、Ⅱ类整合子阳性率分别为78.3%和4.7%,其中Ⅰ、Ⅱ类基因盒检出率分别占28.7%和50.0%。临床CRE和粪便CRE均以Ⅰ类整合子为主,Ⅲ类整合子未检测出。另外,在Ⅱ类整合子中检测出两种新的耐药基因盒结构。7.CRE中ISCR及其基因盒 在所有CRE中检测ISCR1阳性率为69.8%,其中基因盒检出率占4.44%。临床CRE中ISCR1检出率为71.7%,粪便CRE中ISCR1检出率为63.3%。8.质粒接合转移试验 阳性接合子可检测到相关耐药基因,且有表达出对碳青霉烯类抗生素耐药的特性,表明耐药基因位于质粒上,有水平转移的可能。9.ERIC-PCR基因分型 来自临床CRE和粪便CRE的肺炎克雷伯杆菌有一半以上比例的菌株表现出超过90%的相似性,而阴沟肠杆菌和大肠埃希菌基因分型差异性较大。10.全基因组测序分析 从临床CRE和粪便CRE中各选择出一株携带blaKPC-2基因的CRKP,比较分析两菌株的染色体和质粒结构结果显示两株菌高度相似,由此可见临床来源CRKP与粪便来源的CRKP关系密切。根据两株KPC-CRKP对四环素和替加环素敏感性不同,发现soxR基因突变和MarR家族转录调节基因与肺炎克雷伯杆菌对替加环素和四环素的敏感性下降有关。研究结论1.本研究中99株临床CRE和30株粪便CRE从菌种分布、携带的耐药基因的种类和比率、ERIC基因分型及全基因组学分析这些方面进行比较分析,结果显示临床来源CRE和粪便来源CRE分子特征十分相似。因此,加强粪便管理和监测对CRE的预防和控制至关重要。2.MarR家族转录调节基因和soxR基因突变与肺炎克雷伯杆菌对替加环素和四环素的敏感性下降有关。