论文部分内容阅读
目的:本课题组前期于藤黄酸衍生物中提取并结构改造后,得到针对组蛋白甲基化转移酶EZH2的特异性抑制剂GNA002,体内外研究证实了其有效的抗肿瘤作用。HSP90抑制剂一般被作为放化疗辅助用药。本研究为证实GNA002与HSP90抑制剂17-DMAG的联合用药方案的有效性,在体外细胞水平及体内动物水平,验证2种抑制剂联合应用对口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)的生长抑制作用,并初步评估药物联合应用的毒性;同时,对EZH2抗肿瘤作用的相关机制进行探索和分析。方法:本研究通过MTT实验、克隆形成实验和AnnexinV/PI标记流式细胞术比较药物联合应用在体外对细胞生长的影响;采用激光共聚焦的方法鉴定药物联合应用后OSCC细胞核中EZH2的表达水平变化,Western blot验证应用两种药物时细胞内EZH2、HSP90及EZH2底物H3K27me3水平的变化;免疫沉淀实验观察药物联合应用对EZH2泛素化水平的影响。建立裸鼠移植瘤模型,观察两种药物联合应用的体内抗OSCC作用的有效性及毒副作用;对移植瘤组织进行Ki-67免疫组化染色比较细胞增殖差异,TUNEL染色比较细胞凋亡差异,Western blot验证不同处理组瘤体组织中EZH2、HSP90及H3K27me3水平变化。实时荧光定量PCR及Western blot检测EZH2被抑制后OSCC细胞中PD-L1、STAT1水平的变化。利用小干扰RNA转染方法敲减OSCC细胞中PD-L1,体外细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验和Transwell侵袭等实验方法,比较敲减PD-L1后OSCC细胞生物学行为的变化;实时荧光定量PCR比较OSCC组织与癌旁正常组织PD-L1表达水平的差异,并进行PD-L1表达与临床病理特征相关性分析。结果:MTT实验证实,克隆形成实验和流式细胞术联合应用2种药物时对OSCC细胞生长抑制作用最强;免疫荧光染色证实肿瘤细胞核中EZH2的表达水平最低;Western blot也证实,联合用药后细胞内EZH2及H3K27me3水平最低;免疫沉淀实验发现,联合用药能提高OSCC细胞内EZH2的泛素化水平。动物实验证实,联合用药对OSCC裸鼠移植瘤生长抑制作用最强,联合用药组裸鼠体重较单用药组无明显下降;HE及免疫组化染色后发现,联合用药组移植瘤组织中角化珠形成数目增多,Ki-67表达水平最低;TUNEL染色证实联合用药组细胞凋亡数目增多。实时荧光定量PCR及Western Blot证实,在EZH2得到抑制后,OSCC细胞PD-L1的mRNA及蛋白水平表达均降低。小干扰RNA敲减肿瘤细胞PD-L1后发现,敲减株细胞的增殖、克隆形成、划痕愈合及侵袭能力均下降;实时荧光定量PCR发现,OSCC组织PD-L1表达比癌周正常组织升高;EZH2可以影响OSCC中PD-L1的表达,且可能与EZH2对STAT1甲基化调节有关;分析发现,口腔鳞癌组织中PD-L1的表达与肿瘤的大小存在明显相关性。结论:EZH2抑制剂GNA002与HSP90抑制剂17-DMAG联合应用,在体内外均能达到比单一用药更好的抗OSCC生长效果,联合用药没有表现出更明显的毒副作用;这种联合用药作用可能与EZH2的泛素化降解增加有关。研究还表明,EZH2可以通过STAT1影响OSCC中PD-L1的表达;PD-L1与OSCC的肿瘤生物学行为有关。