杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是一种常见革兰氏阴性条件致病菌,宿主谱十分广,它能够感染多种鱼类。该菌感染范围广,传染能力强,能够引起鱼类系统性的出血性败血症、造成皮肤损伤,还能引起鱼类的各器官坏死溃疡,对水产养殖业行业危害巨大。目前,抗生素依然是治疗杀鱼爱德华氏菌病的主要重要手段,而抗生素的滥用导致了细菌耐药性,现在甚至已经出现了多重耐药菌株。随着致病菌对抗生素的敏感程度越来越低,疫苗免疫更加受到人们的重视,通过基因工程技术构建的弱毒疫苗能有效刺激机体系统免疫应答,以浸泡、注射、口服多种途径对水产动物提供持久的免疫保护。crp基因编码蛋白c AMP受体蛋白（c AMP receptor protein,Crp）,最早是在大肠杆菌分解代谢产物阻遏过程中被鉴定,随后发现它属于细菌的转录激活蛋白。有大量研究表明Crp与细菌生长代谢和毒力调控相关,crp基因缺失后细菌毒力下降,具备成为减毒活疫苗的潜力。本课题通过同源重组的方法敲除杀鱼爱德华氏菌crp基因获得Δcrp基因缺失株,并对Δcrp的生物学特性、毒力和免疫保护力进行研究。主要结果如下:1、Δcrp基因缺失株的构建以自杀性质粒p RE112为载体通过同源重组方式构建crp基因缺失突变株,首先将crp基因上游同源臂和下游同源臂通过overlap PCR连接后,克隆至自杀性质粒p RE112中,获得重组质粒p RE112-Δcrp,再通过接合转移将重组质粒p RE112-Δcrp由供体菌χ7213转入受体菌杀鱼爱德华氏菌野生株,获得氯霉素抗性单交换菌株。然后通过传代,挑取氯霉素抗性丢失的候选菌株,PCR鉴定确认crp基因缺失株Δcrp构建完成。2、Δcrp的生物特性研究通过生长特性研究发现杀鱼爱德华氏菌缺失crp基因缺失后生长速率显著减缓,并且失去了利用麦芽糖作为碳源的代谢能力。运动实验中野生株能够形成3.0±0.2cm的运动菌圈,而突变株Δcrp几乎看不到菌圈,表明Δcrp与野生株相比失去了运动能力。在斑点叉尾鮰鱼血杀伤实验中,Δcrp和野生株分别与鱼血混合作用2h后,在血液中野生株剩余活菌量为初始值的86.94%,Δcrp剩余活菌量仅为初始值的38.03%,表明Δcrp相对于野生株抗血液杀伤能力显著减弱。同样在混合感染实验中,斑点叉尾鮰血液、腹水、肝脏、脾脏、体肾、头肾中Δcrp的载菌量相较于野生株降低了1-2个指数级,显著低于野生菌株,表明crp的缺失降低了细菌抗宿主免疫清除能力。综上结果表明杀鱼爱德华氏菌的crp基因与其生长、碳代谢、运动以及抗免疫清除能力相关。3、Δcrp的毒力和免疫保护力的评估分别以斑马鱼和斑点叉尾鮰为生物模型,进行了LD₅₀和免疫保护力的测定。在斑马鱼模型中,Δcrp的LD₅₀比野生株的LD₅₀高约40倍。在斑点叉尾鮰模型中,Δcrp的LD₅₀比野生株的LD₅₀高10倍。对感染后斑点叉尾鮰的肝脏、头肾、以及体肾中1L-1β、TNF-α、γ-IFN的m RNA水平检测发现Δcrp引起的可控炎症反应可以促进宿主对细菌的有效清除。在免疫保护力实验中,经Δcrp免疫的斑马鱼和斑点叉尾鮰再次被野生株感染时,斑马鱼和斑点叉尾鮰存活率分别为70%和90%,且均表现出发病时间延后,发病症状减轻,存活率提升;对应的PBS组存活率分别为10%和20%。以上结果表明,crp基因缺失后,杀鱼爱德华氏菌毒力显著下降,且Δcrp对斑马鱼和斑点叉尾鮰均具有一定的免疫保护效果。综上所述,本研究发现crp基因编码产物参与调控杀鱼爱德华氏菌的生长、碳代谢及运动相关基因,并且在杀鱼爱德华氏菌逃逸宿主免疫清除过程中发挥重要作用。同时,Δcrp对于杀鱼爱德华氏菌的感染能够提供一定程度免疫保护,具有进一步开发为减毒活疫苗的潜质。