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病毒诱导的基因沉默( virus-induced gene silencing， VIGS)是近年来发展出的一种借助于植物病毒载体来抑制目的基因表达从而达到研究植物基因组功能的强有力的研究工具。作为一项典型的逆向遗传学实验手段，VIGS由于具有操作简单、作用周期短、成本低廉等优点，因而在当今生命科学领域发挥着不可或缺的作用。病毒载体通过携带一段植物同源功能基因cDNA，侵染植物后诱导植物内源功能基因发生沉默，从而能在植物的表型突变或生理指标上反映该基因的功能。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus， CMV)是典型的三分体单链正义RNA病毒。基于该病毒具有寄主范围广、复制水平高、基因组简单等优点，本研究试图从外源基因插入的位点及其插入片段的长度两个方面分析CMV作为VIGS载体的分子特性。
本研究主要利用分子生物学方法，构建了插入GFP ORF片段的重组病毒CMV-2420-GFP、CMV-2546-GFP与CMV-2660-GFP。由于CMV的2b蛋白是植物在病毒侵染后发生PTGS的沉默抑制因子，对寄主植物PTGS发生很强的抑制作用，因此我们采取使用外源片段替换2b的策略。而不表达2b蛋白的突变体Fny-CMV△2bpro在之前的实验已经证明在心叶烟和本生烟上均产生轻微症状，致病性显著低于Fny-CMV。这使得2b突变的CMV具有VIGS载体所要求的病毒致病性低的优点，使CMV作为VIGS载体成为可能。
重组体病毒CMV-2420-GFP、CM V-2546-GFP与CMV-2660-GFP是在CMV RNA2上选取三个位点插入完整的GFP ORF片段，这三个位点分别对应Fny-CMV RNA2第2420位、2546位以及2660位核苷酸。由于2660是2a蛋白自然终止位点，因此只有重组株CMV-2660-GFP拥有完整的2a蛋白ORF区。
为了探讨具有不同2a蛋白的CMV突变株在寄主体内复制水平的差异，我们选用转PVX沉默抑制子Hc-pro蛋白的转基因三生烟作为病毒的适应性寄主，分别将三组病毒转录接种至其中。我们发现重组RNA2具有细胞间移动能力，但缺乏途经筛管的系统移动能力。转接三代后提取总RNA进行RT-PCR显示，三株重组病毒在GFP插入区均发生缺失突变，经测序鉴定，CMV-2420-GFP中仅剩下5’端23bpGFP同源区，CMV-2546-GFP和CMV-2660-GFP剩下5’端110bp左右同源区。这说明，GFP基因编码区717bp的序列长度已经超出了CMV RNA2可插入最长片段的极限，原因可能是一个CMV病毒粒子可能包装的核酸长度小于3450bp，推测极限长度约为3400bp以内。
转接数代后发现，CMV-2546-GFP已不能系统侵染转Hc-pro三生烟，原因有待进一步研究。而提取总RNA杂交显示，CMV-2660-GFP积累量远高于CMV-2420-GFP和CMV-PDS747，说明CMV-2660-GFP在此寄主中的适应性远高于CMV-2420-GFP和CMV-PDS747，即完整2a蛋白与1a蛋白以及寄主中的蛋白因子组成的RNA复制酶复合物合成病毒RNA的效率显著高于后两者中包含不完整2a蛋白的复制酶复合物。
不同的是，CMV-2546-GFP在本生烟16c中仍然能够系统侵染，并且有效地沉默了寄主烟中GFP的表达。从病毒积累量上看，4株实验病毒均有良好的适应性，其中CMV△2bpro的积累量最高，原因可能是序列中不含GFP同源序列并且其编码完整2a蛋白，具备完整CMV复制酶复制效率。CMV-2420-GFP由于仅含有23nt一致同源的GFP序列，不能有效的引发VIGS，因此其病毒积累量也并未受到较大影响，同样其接种植株的GFP mRNA也没有被RNA沉默机制所降解，积累水平与Mock无显著差别，与肉眼观察的症状一致。三株重组病毒中诱发沉默效果最好的是CMV-2660-GFP，它与CMV-2546-GFP同含一段长为110bp左右的GFP同源序列，但诱导沉默效果明显好于CMV-2546-GFP，因此，在沉默报告基因GFP的效果上，位点2660是最优插入位点。
通过研究不同长度插入片段对沉默效果的影响，我们发现，对于PDS基因的沉默效果，插入PDS cDNA在小于500bp左右时，沉默效果与插入片段长度呈正相关。但插入片段在300-500bp之间时，PDS沉默效率差异不大，因此我们认为此之间长度的插入片段能够最为有效地诱导沉默。同时，我们发现，在PDS mRNA高于正常水平（以Mock作参考）的60％时，寄主植株不显示明显的光漂白症状，我们推测原因可能是60％左右的PDS蛋白即可满足生成足够量的类胡萝卜素对本生烟叶片的叶绿素进行光保护。对于超出500bp的插入片段的沉默效率并未显示出比Fny-CMV-2420-PDS353更高的沉默效率，提示我们所插入的cDNA片段本身的序列特点可能会对诱导沉默的siRNA的生成产生影响，从而导致了沉默效率的不同。值得一提的是，突变后的Fny-CMV-2660-PDS353虽然仅剩下40bp左右的同源区，其沉默诱导效率仅低于Fny-CMV-2420-PDS353和Fny-CMV-2420-PDS512，这说明CMV RNA2上外源片段插入位点也会对沉默效率产生影响，直接原因可能在于通过影响CMV在寄主体内积累量来产生更多的GFP特异的siRNA启动VIGS。