急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由肺炎、败血症、创伤等非心源性刺激引起的肺部疾病,其发病率和死亡率高达40%,以弥漫性肺泡损伤、难治性低氧血症和非心源性肺水肿为特征,氧化应激和炎症是该病的重要致病机制。尽管在ALI治疗中使用了一系列的治疗方法,如吸入一氧化氮和糖皮质激素,但这些治疗方法都没有被证明能够有效降低死亡率或改善存活者的生活质量。因此,研发用于治疗ALI的补充和替代药物是十分迫切的。大蒜(Allium sativum),球根状的多年生植物,已被证明拥有广泛的药理作用,这主要归因于其中的有机硫化合物成分。SAMC是大蒜中的水溶性含硫化合物之一,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗癌、保肝、预防COPD等多种药理活性。虽然SAMC的药理作用研究在不断发展,但是其溶解性也限制了其进一步的研究,目前还没有将SAMC制成新剂型以改善其理化性质的报道;此外,对SAMC的药理活性的研究多集中在抗癌活性的评价,鲜有将SAMC应用于治疗ALI的研究报道。因此,本课题拟通过制备纳米混悬剂来改善SAMC的溶解度和溶出速率,并且对SAMC应用于治疗ALI的药效及相关的分子生物学机制进行初步研究。本论文的研究内容分为以下四个部分:(1)SAMC纳米混悬剂的制备及表征;(2)SAMC纳米混悬剂冻干制剂的制备;(3)SAMC体外抗炎抗氧化作用及机制研究;(4)SAMC纳米混悬剂对小鼠急性肺损伤的治疗作用及作用机制研究。1.SAMC纳米混悬剂的制备及表征:该部分研究内容包括建立SAMC的含量测定方法学、SAMC纳米混悬剂的处方筛选、制备工艺优化和理化性质表征。首先,采用高压微射流均质法制备SAMC纳米混悬剂,并且以粒径、粒径分布和短期物理稳定性为指标进行处方筛选和工艺优化,考察稳定剂的种类、药物与稳定剂的比例、均质压力和均质循环次数对SAMC-NS的粒径和PDI的影响。然后,对最优处方进行理化性质的评价,包括粒径、PDI、Zeta电位值、外观和透射电镜形态。结果表明,SAMC纳米混悬剂呈现澄清透明溶液状,透射电镜图显示粒子形态呈现类球形,粒径分布均匀,平均粒径为275.93±4.66 nm,PDI为0.124±0.025,Zeta 电位值为-18.97±1.05 mV。2.SAMC纳米混悬剂冻干制剂的制备:该部分的研究内容包括考察SAMC纳米混悬剂的冻干工艺、SAMC-NS冻干品的质量评价、饱和溶解度和体外溶出度的测定。为进一步提高SAMC纳米混悬剂的稳定性,我们采用冷冻干燥法将SAMC-NS制成冻干制剂。以冻干品的外观、色泽和再分散性为考察指标,对常用的冻干保护剂以及加入量进行了筛选,最终选择5%(w/v)的甘露醇作为SAMC纳米混悬剂的冻干保护剂。对冻干品进行质量评价,包括冻干品外观、再分散性、复溶后的粒径、PDI和Zeta电位值。质量评价结果显示SAMC-NS冻干制剂呈现疏松细腻的白色多孔粉末、再分散性良好、复溶后粒径为394.60±9.51 nm,PDI为 0.450±0.090,Zeta 电位为-18.43±5.61 mV。对 SAMC-NS 冻干粉、SAMC 原料药以及SAMC与辅料混合物的饱和溶解度进行比较,结果表明,将SAMC制成纳米混悬剂后,其溶解度为1.87±0.05 mg/ml,比起SAMC的原料药,溶解度有显著的提高。用浆法考察SAMC-NS冻干制剂的体外溶出行为,结果表明,SAMC-NS冻干粉末大大提高了 SAMC的溶出速率。在2 min时,SAMC-NS冻干粉的累积溶出度高达93.9%,而原料药仅为21.0%,原料药与辅料的物理混合物仅为17.9%,SAMC-NS的累积溶出度提升了近5倍。3.SAMC体外抗炎抗氧化作用及机制研究:该部分的研究内容包括炎症因子mRNA表达水平的测定、氧化应激标志物的测定以及SAMC抗炎和抗氧化相关信号通路的探究。采用LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞建立体外模型,然后加入不同浓度的SAMC处理细胞。24 h后,测定炎症和氧化应激标志物的水平变化,并采用Western blot技术检测相关信号通路蛋白的表达。实验结果显示,SAMC可以通过减少NO的分泌量、降低TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA的表达水平来减弱炎症反应。同时,SAMC可以减少MDA的含量,增加SOD和GSH的水平来逆转氧化应激。Western blot实验结果显示,SAMC发挥体外抗炎和抗氧化作用的分子生物学机制是抑制NF-κB信号通路和激活Nrf2信号通路。4.SAMC纳米混悬剂对小鼠急性肺损伤的治疗作用及作用机制研究:该部分的研究内容包括急性肺损伤小鼠模型的建立、SAMC-NS对ALI小鼠肺水肿程度的影响、肺组织病理评价、SAMC-NS抗炎和抗氧化作用评价以及相关信号通路的探索。采用气管滴注的方式建立体内ALI小鼠模型,30 min后,分别灌胃给药SAMC-NS(10、30、60 mg/kg)或阳性对照药N-乙酰半胱氨酸(NAC,500 mg/kg)。24 h后处死小鼠,收集小鼠的肺灌洗液及肺组织进行SAMC-NS的药效学评价及作用机制研究。研究结果显示,给予ALI小鼠SAMC-NS治疗后显著改善了 ALI小鼠肺组织的病理损伤,减弱了肺水肿程度。肺灌洗液中的炎性细胞计数和ELISA实验结果证明,SAMC-NS可以通过抑制炎性细胞的渗入和浸润以及抑制炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌来调节炎症。另外,对肺组织匀浆中氧化应激标志物的测定结果指出,SAMC-NS通过降低MDA的水平以及减少抗氧化物SOD和GSH的消耗来减轻LPS引起的氧化应激。采用Western blot和免疫组化手段探究SAMC-NS治疗ALI的机制。实验结果显示,SAMC-NS通过抑制NF-κB信号通路的活化,进而抑制炎症介质iNOS和COX2的蛋白表达来调节炎症。同时,SAMC-NS通过激活Keap1/Nrf2信号通路来上调抗氧化/解毒蛋白的表达来逆转氧化应激,包括HO-1和NQO1蛋白。综上,SAMC-NS对ALI的治疗作用很大程度上是通过抑制炎症和氧化应激,涉及的信号通路包括NF-κB 和 Keap1/Nrf2 信号通路。综上所述,本课题首先针对SAMC的溶解性不佳问题,采用高压微射流均质法制备了 SAMC纳米混悬剂,并考察了其理化性质。另外,为进一步提高SAMC-NS的稳定性,本课题通过冷冻干燥技术将SAMC纳米混悬剂制成冻干粉剂并且对其进行质量评价。研究结果显示,将SAMC制成纳米混悬剂后显著提高了其溶解度和体外溶出度。然后,本课题在细胞和动物两个水平评价了 SAMC对急性肺损伤的治疗作用并对其作用机制进行了探究,研究结果显示,SAMC对急性肺损伤有良好的治疗作用,其作用机制是SAMC可以通过调控NF-κB和Nrf2信号通路来有效抑制炎症和氧化应激。