论文部分内容阅读
α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase，EC3.2.1.22)，也称蜜二糖酶，是一类能够催化水解末端含α-1，6-半乳糖苷键的酶类，包括线形和分支寡糖，多糖以及人工合成的底物，如蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖；多聚半乳甘露糖和对硝基-α-D半乳糖苷。
为了促进蔗糖的结晶和提高其产率，α-半乳糖苷酶已经被用于甜菜制糖工业中棉子糖清除。它在来源于豆粕的食品加工过程中的潜在应用也已经被得到证明。而且，使用半纤维素酶包括α-半乳糖苷酶在纸浆工业的应用也引起了人们浓厚的兴趣，因此，α-半乳糖苷酶具有广泛的应用前景，特别是在食品和饲料工业。
本论文针对α-半乳糖苷酶在食品、饲料、医药工业等领域应用的过程中存在的酶单位产量较低、胞内提取困难、生产成本居高不下、酶学性质欠佳等关键问题。为了克服这些不足，利用基因工程手段是开发具有优良特性α-半乳糖苷酶进行高效生产的有效途径。这些问题解决有助于该酶的大规模推广和使用。这对于提高蔗糖的得率和品质、改善豆粕蛋白能量的利用率、治疗法布里氏疾病以及血液转换等方面都具有十分重要的意义。
本论文是从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中发酵排放处采集土样，利用选择性培养基，一株能够产热稳定α-半乳糖苷酶的耐热真菌得到了分离纯化，经形态学和分子生物学鉴定确认这株真菌为分枝犁头霉(Absidiaramosa)暂定名为WL511。该菌株生长的最适温度和pH是47℃和7.0，所产酶为胞内酶，酶活研究表明粗酶液的最适温度和pH是68℃和7.0。
来源于分枝犁头霉WL511α-半乳糖苷酶的基因组DNA和cDNA序列被克隆。序列分析表明，该α-半乳糖苷酶基因组DNA序列全长2623bp，含有6个内含子(intron)和5个外显子(extron)组成；cDNA编码区长2228bp，其中一个完整的ORF长度是2142bp，编码713氨基酸残基的多肽，推测分子量是81kDa，氨基酸序列中共含有4个潜在的糖基化点，将不同来源的α-半乳糖苷酶基因与此基因进行比较发现，该基因与其他α-半乳糖苷酶的同源性较低，最高的是与链霉菌StreptomycesavermitilisMA-4680的α-半乳糖苷酶为38％，该基因已经在Genebank中登录，登录号为DQ234280。
将克隆的α-半乳糖苷酶基因连接在pQE30载体，重组质粒转化大肠杆菌E.coilM15，阳性转化子用IPTG在不同温度诱导3小时，IPTG诱导的最终浓度达0.5mM，SDS-PAGE和α-半乳糖苷酶活分析表明克隆的基因能够在温度18℃时以包涵体形式表达，但表达蛋白没有活性。为了实现高效分泌表达，将克隆的α-半乳糖苷酶基因连接在pPICZαA构建重组质粒pPICZαA-aga，用电转化的方法将重组质粒pPICZαA-aga整合在毕赤酵母PichiapastorisGS115的染色体上，其中8＃重组酵母实现了α-半乳糖苷酶的高效分泌表达，表达产物具有生物活性。发酵上清液的酶活达32U/ml，采用镍亲合层析方法将重组蛋白纯化，纯化酶的比活力为137U/mg，SDS-PAGE电泳显示为单一条带，凝胶过滤和SDS-PAGE所估算的分子量分别为348kDa和87kDa，推测来源于分枝犁头霉WL511α-半乳糖苷酶是四聚体，在毕赤酵母P.pastoris表达的分子量比原酶大6kDa是由于糖基化引起。其等电点为5.2。该酶的最适反应温度为73℃，最适pH6.8，在60℃以下及pH5.5-9.0范围内活性稳定。在75℃时保温2小时保留54％的酶活，85℃时酶活完全消失。Hg2+、Fe3+、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用，而巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和谷光甘肽对该酶有不同程度的激活作用，其它金属离子和EDTA和邻二氮杂菲对酶活没有明显的影响。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物，该酶动力学参数分别是：Km值为0.42mM；Vmax分别为413Umg-1；kcat为64531min-1。Kcat/Km作为酶的特异性分析指标，因此在所实验的底物中，对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷是最适底物。
总之，一株耐热分枝犁头霉WL511的热稳定α-半乳糖苷酶基因已经被克隆和测序，重组蛋白已经被分离和纯化。所研究的纯酶与目前已经报道的至少在以下几个方面(分子量、等电点、最适pH和温度)之一不同，表明这是一个新的α-半乳糖苷酶。这些同工酶的不同性质表明生物进化的多样性和α-半乳糖苷酶基因在不同微生物之间的转移。同时，该热稳定α-半乳糖苷酶基因的成功克隆和分泌表达为工业应用提供低成本和高质量的酶制剂打下基础，具有重要的理论意义和应用潜力。