肿瘤是一种细胞周期性疾病,肿瘤的发生与细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻密切相关,因此与细胞增殖有关的周期蛋白成为研究癌症发生的热点之一细胞周期的变化是一个复杂的过程,许多蛋白参与调控该过程。其中D型周期蛋白作用于G1期,分为3个亚型：Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3。但只有Cyclin D1被检测到在肿瘤中过度表达。Cyclin D1又存在Cyclin Dla和CyclinDlb两种亚型,通常Cyclin D1即指Cyclin D1a。正常的细胞周期有序的循环是通过激活和失活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)来实现的。CyclinD1作为细胞周期进程的启动子,可以与CDK4结合形成复合体,通过磷酸化和失活视网膜母细胞瘤蛋白pRb,促进细胞周期从G1期到S期的进展,并通过这种方式介导DNA的合成、促进细胞的生长增殖。而Cyclin D1在不依赖CDK的情况下同样可以对细胞生长、分化和新陈代谢发挥作用。研究表明,Cyclin D1在人类多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌以及造血系统恶性肿瘤中存在过度表达。在侵袭性乳腺肿瘤中,50%病例存在Cyclin D1蛋白的过度表达。为了探讨Cyclin D1在肿瘤中的作用,我们做了大量研究。我们发现Cyclin D1缺失的小鼠会耐受致癌基因诱导的肿瘤发生；Cyclin D1基因的缺失也可以降低细胞存活和DNA合成,增加线粒体的大小和活性,抑制血管、骨髓巨噬细胞、成纤维细胞和乳腺上皮细胞的迁移能力。临床病例也显示CyclinD1过度表达与肿瘤转移存在联系。因此,疾病的恶性进展和转移可能与CyclinD1密切相关。细胞的迁移在细胞形态发生、组织修复和肿瘤转移中是必不可少的。肿瘤转移是从肿瘤原发病灶的肿瘤细胞的迁移开始的,经过进入血管的内渗和穿过血管壁的溢出过程,最后到达远处器官或组织从而产生新的肿瘤。抑制肿瘤转移是我们治疗肿瘤的重要途径。因此,了解细胞迁移或侵袭机制会帮助我们更好的理解肿瘤细胞的散布机制并为肿瘤治疗带来新的契机。探讨Cyclin D1在迁移或侵袭中的作用可以给我们的研究指明新的方向。大量研究发现Cyclin D1在调节雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)等的转录活性时,必须要结合辅助激活因子或转录因子。因此我们推测Cyclin D1在细胞生长、迁移及肿瘤中的作用是通过结合特殊的蛋白质形成复合物而产生的。为了研究Cyclin D1结合蛋白在调节Cyclin D1功能中的作用,我们纯化Cyclin D1结合蛋白复合物并发现了神经元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物2(Protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 2, PACSIN2)。PACSIN2是来源于鸡心脏的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源体,它的家族成员在功能上被看作是细胞黏着斑中的胞浆辅助蛋白,参与囊泡的形成与运输。本课题就Cyclin D与(?)PACSIN2在影响细胞迁移中的作用进行研究。一、发现并鉴定PACSIN是一种Cyclin D1结合蛋白,并探讨其结合机制目的：发现并鉴定出PACSIN2是一种Cyclin D1结合蛋白,探讨PACSIN2是否可以特异性的结合Cyclin D1而非其他家族成员及其结合机制。方法：1.通过免疫沉淀方法纯化Cyclin D1结合蛋白,并经过银染电泳凝胶、凝胶片切除及消化过程,最后进行质谱测定分析和序列分析。2.将带有Flag抗原标记的不同Cyclin D1质粒DNA,包括野生型和突变型DNA,分别和带有Myc抗原标记的(?)PACSIN2质粒DNA,使用磷酸钙转染的方法共转于293T细胞。通过免疫沉淀-免疫印迹的方法分析该细胞。3.将带有Flag抗原标记的不同Cyclin D质粒DNA,包括Cyclin D1,D2和D3及其突变型DNA,分别和带有Myc抗原标记的PACSIN2质粒DNA,使用磷酸钙转染的方法共转于293T细胞。通过免疫沉淀-免疫印迹的方法分析该细胞。4.将带有Myc抗原标记的不同(?)(?)ACSIN质粒DNA,包括PACSIN1,PACSIN2和(?)(?)ACSIN3 DNA分别和带有Flag抗原标记的Cyclin D1质粒DNA,使用磷酸钙转染的方法共转于293T细胞。通过免疫沉淀-免疫印迹的方法分析该细胞。5.将带有Myc抗原标记的不同PACSIN2质粒DNA,包括野生型和变异型DNA,分别和带有Flag抗原标记的Cyclin D1质粒DNA,使用磷酸钙转染的方法共转于293T细胞。通过免疫沉淀-免疫印迹的方法分析该细胞。结果：1.通过纯化Cyclin D1结合蛋白,得出CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶),70kD热休克同源蛋白(Hsc70)和一种额外的蛋白质。经过质谱测定分析和序列分析,鉴定出这种蛋白是PACSIN2。这种蛋白被看做是来源于鸡心脏的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源体。2.敲除细胞周期蛋白的酸性氨基酸序列后,Cyclin D1无法与PACSIN2结合。只有Cyclin D1和Cyclin D2可以与(?)(?)ACSIN2结合,但Cyclin D3、yclin D1b不能与其结合。3.免疫沉淀-免疫印迹实验发现PACSIN家族中只有PACSIN2可以和CyclinD1特异性的结合,PACSIN1和PACSIN3不能和Cyclin D1结合。4.通过敲除(?)pACSIN2蛋白序列上NPF结构域可以使得PACSIN2失去与Cyclin D1结合的能力。结论：1.发现并鉴定出PACSIN2是可以与Cyclin D1特异性结合的Cyclin D1结合蛋白。2. Cyclin D1通过其羟基末端的E-rich基序与PACSIN2结合。3. PACSIN2通过其NPF结构域与Cyclin D1结合。二. PACSIN2抑制正常细胞和肿瘤细胞的迁移能力,是通过与Cyclin D1a结合而非Cyclin D1b实现的；目的：观察Cyclin D1和(?)(?)ACSIN2在细胞中的蛋白结合共存位置,并确定作为CyclinDl结合蛋白的PACSIN2的生物学功能,以及其功能的发挥是否依赖于Cyclin D1。方法：1.在MRC5细胞(人胚胎肺成纤维细胞)中通过免疫组织化学染色方法观察Cyclin D1和(?)(?)ACSIN2蛋白结合共存位置2.通过Transwell migration assay分析PACSIN2基因敲除型和野生型小鼠皮肤成纤维细胞迁移能力的区别。3.通过特异性siRNA降低LNCaP细胞(人前列腺癌细胞)中PACSIN2蛋白表达水平后,Transwell migration assay分析其迁移能力的变化。4.通过特异性siRNA降低3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)中PACSIN2蛋白表达水平后,Cell spreading assay观察细胞伸展能力的变化。5.分别在Cyclin D1敲除的小鼠上皮成纤维细胞Cyclin D1-/-细胞,以及该细胞经过Cyclin D1a、Cyclin D1b质粒DNA转导后的两种细胞Cyclin D1-/-+D1a细胞和Cyclin D1-/-+D1b细胞中,使用特异性siRNA降低PACSIN2蛋白表达水平后,通过Transwell migration assay观察细胞迁移能力的变化,Cell spreading assay分析其伸展能力的变化。结果：1.MRC5细胞中,Cyclin D1和(?)(?)ACSIN2结合共存于细胞膜皱褶中。2. PACSIN2基因敲除后,小鼠皮肤成纤维细胞的迁移能力增强；(?)PACSIN2 siRNA可以增强人前列腺癌细胞LNCaP的迁移能力,降低小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞的伸展能力。3. PACSIN2 siRNA可以增强Cyclin D1-/-+D1a细胞的迁移能力,降低细胞的伸展能力；但是在Cyclin D1-/-细胞和Cyclin D1-/-+D1b两组细胞中没有变化。结论：1.内源性PACSIN2可以抑制人前列腺癌细胞和小鼠成纤维细胞的迁移能力,增强小鼠成纤维细胞的伸展能力。2.在Cyclin Dla存在的前提下,PACSIN2才能发挥其抑制细胞迁移、增强细胞伸展的能力。总之,作为Cyclin D1的结合蛋白,(?)ACSIN2通过其结构中NPF区域与CyclinD1a的羟基末端特异性结合而发挥其抑制细胞迁移、增强细胞伸展的能力。因此,研究Cyclin D1及其结合蛋白PACSIN2对细胞迁移的影响,为进一步探讨CyclinD1在肿瘤中的作用提供了一个新的方向。