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肠道传播的肝炎病毒包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV),二者均属单股正链RNA病毒,无包膜,主要通过粪口途径传播,并且两种病毒在临床症状、暴发特征和流行病学特征等方面也有许多相似之处。在发展中国家,HAV和HEV能导致严重的疾病暴发,造成巨大的经济损失。已有文献报道因饮用被甲肝病毒和戊肝病毒污染的水源而导致甲型肝炎和戊型肝炎同时暴发的病例。目前,虽然有有效的甲肝疫苗和戊肝疫苗,但是尚没有甲肝和戊肝的联合疫苗可同时预防甲肝和戊肝的暴发。并且,常规的肌肉注射方式与自然感染途径不同,主要诱导血清中IgG的产生,有一定的局限性。而黏膜免疫可以模拟HAV和HEV的自然感染方式,既能诱导局部IgA的产生还可以诱导全身IgG的产生。而且,联合的黏膜免疫比传统的肌肉注射策略更为安全、经济,且易于被目标人群所接受,操作也更加方便。因此,针对HAV和HEV的黏膜疫苗是目前最具潜力的疫苗候选制剂之一。为了增强本课题制备的蛋白抗原的黏膜免疫应答,我们选取了一段具有靶向作用的tuftsin基因,该基因的编码产物是一种小分子免疫刺激肽,其专一性受体存在于巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞等细胞表面,当tuftsin与其靶细胞膜受体特异性结合后,可作为免疫刺激因子增强吞噬细胞对抗原的吞噬、迁移及转运能力,从而提高与其相连的蛋白的免疫原性。本课题探讨了与tuftsin相连的甲型和戊型肝炎病毒中和抗原表位的重组蛋白的黏膜免疫应答,为制备HAV和HEV双价黏膜候选疫苗提供理论基础。我们把含有中和抗原表位的HAV VP1蛋白的部分序列(aa 1-199)和HEV ORF2的部分序列(aa 368-607)作为目的基因,通过基因优化、重组以及PCR、基因克隆、原核表达、蛋白纯化、蛋白鉴定等技术手段将tuftsin分别与HAV VP1(aal-199), HEV ORF2(aa368-607)N端通过甘氨酸linker相连,制备重组抗原蛋白。将上述两种嵌合抗原基因插入表达载体pET43a,构建表达质粒pET43a-HA-VP1-tuftsin、pET43a-HE-ORF2-tuftsin,同时构建不含tuftsin和linker的对照组质粒pET43a-HA-VP1及pET43a-HE-ORF2,然后将质粒转化入大肠杆菌BL21进行表达。结果表明pET43a-HA-VP1-tuftsin及对照质粒pET43a-HA-VP1, pET43a-HE-ORF2-tuftsin及其对照质粒pET43a-HE-ORF2均能在BL21中高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量分别约为23KD、23KD、28KD、 28KD。通过阴离子交换、蛋白透析复性和蛋白浓缩等技术得到高纯度的四种抗原蛋白HA-VP1-tuftsin. HA-VP1、HE-ORF2-tuftsin和HE-ORF2。之后通过Western blotting和ELISA鉴定蛋白,实验结果均显示HA-VP1-tuftsin和HA-VP1重组抗原蛋白能与HAV抗体阳性血清发生特异性反应,HE-ORF2-tuftsin和HE-ORF2重组抗原蛋白能与HEV抗体阳性血清发生特异性反应。此外,我们通过体内和体外实验分别证实了HA-VP1-tuftsin、HE-ORF2-tuftsin的抗原性和免疫原性。首先对重组蛋白HA-VP1-tuftsin、HE-ORF2-tuftsin及其对照蛋白HA-VP1、HE-ORF2的免疫原性进行了比较。Balb/c小鼠体内实验表明,在滴鼻免疫组,tuftsin增强了抗-HAV和抗-HEV的特异性IgG和IgA抗体滴度,说明tuftsin可以促进特异性IgG的增多,同时也能促进IgA在肠道、阴道、呼吸道和粪便的分泌和产生,提示了tuftsin通过滴鼻免疫能有效地激活体液免疫应答；在肌肉注射组中,tuftsin同样能够增加特异性IgG的滴度但IgA滴度增加的现象却并不明显。此外,ELISPOT实验证明,无论通过肌肉注射还是滴鼻免疫,tuftsin组分泌IFN-γ的T细胞增殖都较为明显,这显示了tuftsin可以有效地激活Thl类细胞免疫应答。流式细胞术结果表明,无论在肌肉注射组还是滴鼻免疫组,tuftsin组与其他组相比,CD4+T细胞都有所增加而CD8+T细胞则有所减少,这使得CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显上升,但是肌肉注射组和滴鼻免疫组之间没有显著差异,这些数据证明tuftsin可以诱发机体特异性CD4+T细胞的分化,抑制CD8+T细胞的增殖。因此,将免疫刺激性分子tuftsin与目的抗原基因连接起来,不但可以加强机体针对抗原蛋白的体液免疫还可以增强其细胞免疫反应。并且综合体液免疫反应和细胞免疫应答两方面的结果显示,滴鼻免疫方式能够更有效的发挥tuftsin在增强黏膜免疫应答方面的作用。同时,我们的研究也详细探讨了蛋白组分HA-VP1-tuftsin和HE-ORF2-tuftsin通过滴鼻联合免疫之后,可能存在的关系及是否会有互相抑制作用。研究结果表明,联合免疫后HA-VP1-tuftsin的免疫原性显著提高,抗-HAV的特异性抗体IgG和黏膜IgA滴度均有所增加,在ELISPOT试验中,联合免疫后产生的IFN-y斑点数也高于单独免疫HAV-VP1-tuftisn蛋白组。而HE-ORF2-tuftsin蛋白的免疫原性虽然没有显著提高但也未受到抑制。综上所述,联合免疫后这两种蛋白组分没有互相抑制作用,并且HAV-VP1-tuftisn蛋白的免疫原性有所增加。综上所述,本研究通过大肠杆菌表达系统成功地表达和纯化了分别含有HAV和HEV中和抗原表位并且连有免疫佐剂分子tuftsin的抗原蛋白,在Balb/c小鼠中通过滴鼻和肌肉注射两种方式,探讨tuftsin能否增强蛋白的黏膜免疫原性。结果显示tuftsin基因能够有效增强偶联的目的蛋白的免疫原性,从而增强机体的体液和细胞免疫反应。并且滴鼻的方式较肌肉注射的免疫方式产生的黏膜免疫应答更有优势。两种有优势的tuftsin蛋白HA-VP1-tuftsin和HE-ORF2-tuftsin之间没有互相抑制作用,而且HA-VP1-tuftsin蛋白激发的体液和细胞免疫应答在联合免疫后均有所增强。因此,含有tuftsin的HAV和HEV蛋白能够有效诱导产生广泛的免疫反应,具有开发为可同时预防HAV和HEV感染的亚单位联合蛋白疫苗的应用前景。