大豆[Glycine max(L.)Merr.]起源于中国,是人类植物性蛋白和食用油的主要来源,在我国国民膳食体系中扮演着重要角色。大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引致的病毒病是一种全球性病害,造成大豆大幅减产和品质恶化。目前,尚无有效的化学药物能够防治SMV,鉴定抗性资源、培育抗病品种是防治SMV最经济、有效、安全的手段。我国是大豆起源国,拥有丰富的品种资源,对我国大豆种质特别是广适大豆品种进行SMV抗性评价,明确大豆主产区SMV抗性时空演变趋势,进而筛选优良抗病种质资源,对SMV抗病育种具有重要意义。此外,转基因技术可以打破物种间的屏障,在较短时期内完成优良抗性基因的定向改造、重组和转移,大幅度缩短抗病育种进程。近年来兴起的CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,为作物育种提供了新的方法策略,有望培育出对SMV具有广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。本研究选取97个在中国大豆主产区大面积种植的大豆品种,进行SMV抗性鉴定。上述品种来源于黑龙江北部地区(NH)、黑龙江中南部地区(MSH)、吉林辽宁地区(JL)、黄淮海流域(HH),育成年份在1923至2006年间。分别接种SC3、SC7、SC8、SC11、SC15和SC18等SMV流行株系。结果表明,6种SMV株系的平均病情指数(ADI)变化范围为26.95-48.97。对不同SMV株系而言,抗病品种的数量(比例)变化范围为27(27.8%)至64个(66.0%),感病品种的数量(比例)变化范围为33(34.0%)至70个(72.2%)。来自NH、MSH、JL和HH地区大豆品种对6种SMV株系的平均病情指数分别为50.82(变化范围为32.31-59.31)、47.27(变化范围为22.52-59.35)、43.10(变化范围为28.97-51.71)和33.05(变化范围为25.05-41.7)。对于NH和JL地区来说,6种SMV株系的病情指数随着品种育成年代的推进呈现出整体下降趋势。反观MSH地区,所有SMV株系的病情指数均随品种育成年份推后表现出不同程度的上升趋势。在HH地区,SC15株系的病情指数呈现明显下降趋势,SC3和SC18株系的病情指数呈现明显上升趋势。对SMV抗性的时空演变分析表明:NH和JL大豆产区应继续保持并不断提高现有的SMV抗病育种水平;MSH大豆产区应加强所有SMV株系的抗病育种工作;HH大豆产区应特别针对SMV株系SC3和SC18进行抗病育种工作。本研究共计筛选出24个具有广谱抗性的大豆品种,这些品种对6种SMV株系的平均病情指数在0.80至35.52之间;共计筛选出13个具有极端抗性的大豆品种,分别有5个和8个品种来自JL和HH大豆主产区,均至少高抗1种SMV株系。对国内外13个SMV流行株系的全基因组序列进行多重核苷酸序列同源性比对,确定出SMV HC-Pro基因正义链[ss(+)RNA]的保守区间为核苷酸位点2039-2309 nt;负义链[ss(-)RNA]的保守区间为核苷酸位点8448-8467 nt。在此基础上,分别搜索其PAM位点,并确定出相似度为100%的gRNA(+)/gRNA(-)靶点序列。通过同源重组反(?)应,分分別就SMV HC-Pro基因正义链和负义链构建了CRISPR/Cas9基因组编辑载体,最终将将鉴定正确的重组载体通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105中。利用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,以SMV感病大豆品种Jack为受体材料,以萌发24 h的成熟大豆子叶节为外植体,以如r基因作为筛选标记进行大豆转基因实验。通过种子萌发、外植体制备、农杆菌侵染液制备、侵染、共培养、丛生芽诱导、芽伸长、生根、炼苗、驯化、移栽等组织培养过程,共计获得抗性组培苗319株。采用除草剂涂抹(200mg/1 Basta)、PCR(gRNA、办Mr)和PAT/kr转基因检测试纸进行鉴定,共筛选出阳性T〇代大豆植株83株。对来自于31个To家系的796个乃代单株进行除草剂涂抹鉴定,共获得1阳性植株493株,之后通过SMV(SC3株系)抗病鉴定、实时荧光定量qRT-PCR和DAS-ELISA血清学实验,分别从表型水平、RNA水平和蛋白水平对阳性乃代大豆植株进行检测分析。抗病鉴定结果表明,SMV(SC3株系)抗性在1代植株中得到一定程度的提升,其中高抗植株(HR)15株(占3.0%)、抗病植株(R)53株(占10.8%)、轻微抗病植株(MR)58株(占11.8%)、感病植株(S)367株(占74.4%)。在接种SMV后15 d和30 d的两个时间点进行qRT-PCR实验,结果表明,随着转化植株抗性水平的降低(HR/R/MR/S),叹^4和办CtwP基因的表达量水平不断下降,SMV病毒积累量(SMVCP基因)不断上升,SMV病毒积累量与;基因的表达量水平呈负相关,说明办基因的转录本对SMV起到了抑制作用,抑制效果与该两个基因的表达量水平密切相关。接种SMV2个月后,对转化植株进行DAS-ELISA分析,结果表明,高抗植株(HR)的数值均低于2.0(SMV阴性),随着转化植株抗性水平的降低(HR/R/MR7S),数值不断增加,均高于2.0(SMV阳性)。此外,还对T2种子的种皮斑驳现象进行了调查,发现随着转化植株抗性水平的降低(HR/R/MR/S),后代褐斑粒数量不断增加,籽粒褐斑面积不断扩大,平均褐斑率逐步上升;HR植株后代籽粒的种皮斑驳现象被彻底消除,与阴性对照无异;阳性对照、R、MR、s类型转化植株后代籽粒的褐斑面积存在明显差异,但它们的平均褐斑率差异却不明显,说明少量的SMV病毒就能够引发大多数后代籽粒的种皮斑驳现象,且后代籽粒的褐斑面积与植株的抗性水平呈负相关。CRISPR/Cas9技术为大豆SMV抗病育种提供了新的方法策略,有望培育出广谱、持久抗性的转基因材料。