桑树是重要的经济林木树种,桑叶是唯一能使家蚕正常新陈代谢的饲料:桑果,即桑椹,具有较高营养价值和保健作用,发展前景广阔。桑树多倍体特别是三倍体植株具有高产,优质,抗逆性强的特点,受到广大育种科技工作者的重视。三倍体桑树品种一般是由优良的四倍体与优良的二倍体杂交后,经选择、培育而获得。自然界的野生四倍体桑树极少,且野生性状强,经济性状较差,不能满足人工三倍体新桑品种选育亲本的要求,人工选配的二倍体杂种F₁植株,经秋水仙碱诱导获得优良四倍体桑植株,因有杂交优势及多倍体效应,具有较高的产叶量,可直接应用于生产,也可用作培育三倍体新桑品种的亲本。因此,四倍体育种亲本材料多由人工诱变创制获取。人工创造四倍体桑育种亲本材料,目前国内外主要采用物理的辐射诱变处理;化学的秋水仙碱诱导处理和生物的杂交技术获得,这三条途径主要在大田进行,受天气,季节影响,周期长。因此本论文主要进行两方面研究,一是采用桑树组织培养与秋水仙碱诱导相结合,在试管内诱导获取人工四倍体桑育种材料,拟克服大田实验的不足之处:二是在大田通过秋水仙碱诱导经杂交选育而成的二倍体桑品种优良单株的萌动冬芽,从中选育出果叶兼用的四倍体桑优系,拟解决农民栽桑经济效益单一的问题。并分析了该四倍体新桑品系与二倍体亲本间,在形态性状、解剖结构及生理生化上的变异,其主要研究结果如下:1.桑树离体高效再生组培体系的研究本研究以提高桑树离体再生植株频率,建立稳定的桑树组织培养技术体系为研究目的,以桑树种胚为材料,自来水冲洗,用0.1%的HgCl₂消毒8 min,无菌水洗4-5次,每次约1 min。消毒后种子放在摇床上或者平摊在灭菌过的培养皿中发芽。用解剖刀切割下胚轴和子叶,并且把下胚轴分成约1.5mm长的上、中、下三段作为外植体,接种在MS培养基附加3 mg·L^-1BA+0.3 mg·L^-1 IAA+30 g·L^-1葡萄糖+7 g·L^-1琼脂粉的培养基中,进行愈伤组织和不定芽诱导。实验结果表明,三段下胚轴之间的不定芽诱导率存在显著差异,下胚轴上段,即靠近胚芽的一段诱导率最高,获得了78.7±2.1%的不定芽诱导率:中段次之,不定芽诱导率为39.5±7.996；下段,即靠近胚根的一段褐化严重,基本上诱导不出不定芽。再以下胚轴上段为外植体,接种在MS培养基添加不同的生长素IAA、2,4-D、NAA、以及不同浓度激素组合中,进行愈伤组织和不定芽的诱导。实验结果表明,在桑树组织培养中,细胞分裂素3.0m g·L^-1 BA与生长素0.3 mg·L^-1 IAA组合对桑树不定芽诱导是最有效的,不定芽的诱导率达到77.6±5.9%；2,4-D诱导的愈伤组织生长快,白色疏松,较难分化出不定芽:AgNO₃对不定芽的诱导有促进作用。适当降低生长素的浓度有利于提高增殖培养的增殖系数。在生根培养中,无机盐的浓度和生长素对生根影响较大,较高的无机盐浓度降低生根率并且延长生根时间,无机盐浓度太低,根系柔弱,影响移栽成活率;在1/2MS+0.5 mg·L^-1 IBA的固体培养基中生根率可以达到99%。移栽成活率也可达到95%以上。该实验结果将为桑树离体条件下诱导多倍体育种材料奠定了基础,也为桑树遗传转化提供了良好的转化受体技术体系。2.桑树组织培养诱导多倍体育种材料的研究本研究以在桑树离体的条件诱导多倍体育种材料为目的,以桑种子、下胚轴、子叶、不定芽为材料,设计了4个实验:（1）用0.15%、0.2%、0.25%的秋水仙碱溶液处理中桑5801与纳溪桑的杂交F₁种子24h、48h、96h,然后接种子叶、胚轴到诱导培养基中。（2）用0.05%、0.1%、0.2%的秋水仙碱溶液处理子叶20min、40min、60min以后接种到诱导培养基中。（3）以2-4 cm长的不定芽分别在0.1%、0.15%、0.2%的秋水仙碱溶液中浸泡2天和3天,然后,用无菌水洗涤4-5次,转接入到新鲜的培养基中,无菌水浸泡作为对照。（4）以0.15%、0.2%、0.25%滴定不定芽的顶芽5天,早晚各一次,两周以后调查不定芽的变异率。实验结果表明,秋水仙碱溶液处理种子及子叶以后经过离体培养,都未获得再生植株；经过秋水仙碱处理过的不定芽生长缓慢,叶片发生畸变,经过体细胞染色体倍数性鉴定,进一步确定桑树四倍体及二倍体。另外,秋水仙碱的浓度是诱导桑树四倍体成功的关键,以0.2%的秋水仙碱浸泡2天后获得桑四倍体的诱导率为14%,以0.25%滴液5天获得了20%的诱导率。经过生根培养,移栽获得再生四倍体植株。该四倍体植株表现出叶片增大,锯齿加深,叶肉变厚,叶色深绿色等性状。既可以作为杂交亲本,也可以在生产上直接利用。这是国内首次在离体条件下,诱导获得的桑树多倍体植株,为桑树多倍体育种材料创制提供了一条新的途径。3.人工四倍体果叶兼用桑新品系的选育研究本研究以满足农民种桑需求,增加农民的亩桑产值,解决蚕农种桑养蚕收效单一,发展我国蚕桑产业为目的,以既产果,又产叶为主要育种目标,采用桑树细胞染色体工程,以我校保存的中桑5801号（二倍体,2n=2x=28）为材料,选育果叶兼用的新型人工多倍体桑树品种。经过观察、调查,从我校保存的中桑5801号中选出发芽早,结果多,生长势旺盛的优良单株,进行了繁殖。2005年2月22日至3月1日,分别用0.2%秋水仙碱溶液:2ppm6-BA+0.2%秋水仙碱溶液;2ppm6-BA+0.25%秋水仙碱溶液:2ppm6-BA+0.22%秋水仙碱溶液,每天早上8:00时,在桑树体细胞进行有丝分裂前一个小时,采用注射器,对11株,277个脱苞冬芽进行化学诱导处理,连续诱导处理8天,然后对诱导处理的冬芽进行培护管理。2005年5-6月,采用植物酶解去壁低渗法,对277个化学诱导处理冬芽的萌发新梢芽叶,逐个进行体细胞染色体倍数性鉴定。2005年12月20日-26日,我们把一个纯合四倍体（2n=4x=56）,2个嵌合体的V1代枝条上的冬芽分别进行了冬季芽接:2006年3月进行嫁接成活率调查,嵌合体的嫁接成活率略高于纯合体株系。2006年5-6月,我们对纯合四倍体（2n=4x=56）V1代嫁接成活的植株,采用植物酶解去壁低渗法,逐一进行体细胞染色体倍数性复查,V1代嫁接成活的15个植株,全为纯合四倍体（2n=4x=56）,命名为嘉陵30号。四倍体果叶兼用桑新品系嘉陵30号桑叶叶片增大,叶肉增厚,叶色加深,节间密,叶序紊乱,产叶量高:桑椹果粒大,紫黑色,果肉肥厚,味道鲜美可口,产果量也高。2006年12-2007年1月嫁接V2代冬芽,经过2007年培护管理,2008年重庆市桑树品种区域实验,桑椹产量达到777.5kg/667m²·年,桑叶产量达到2136kg/667m²·年。这一品种的育成推广,将增加农民收入,提高蚕农亩桑效益,增加蚕农收入,促使蚕桑产业可持续发展。4.桑树果叶兼用四倍体与无性系二倍体亲本形态性状及生化成分的比较分析本研究以了解桑树二倍体经过秋水仙碱诱导成四倍体以后,桑树形态性状,生化成分发生的变化为目的,以诱导获得的人工四倍体果叶兼用桑新品系及其无性系二倍体亲本为材料,从外形特征,桑叶产量,桑椹产量,桑叶蛋白质含量、可溶性糖含量、桑椹的氨基酸含量,抗氧化物酶活性作了比较实验。结果表明,四倍体新桑品系染色体数目增加一倍以后,桑叶的海绵组织增厚,桑叶单株产量提高19.05%,桑椹产量提高16.1%;桑叶蛋白质含量提高10.2%,可溶性糖含量提高10.7%;桑椹的氨基酸含量也明显提高,但不同的氨基酸含量增加的量不同,维生素C含量提高12.9%,多酚含量提高43.3%,总花青素含量提高34.1%,黄酮含量提高47.6%。四倍体桑叶可溶性蛋白质含量和抗氧化物酶活性都高于无性系二倍体亲本。据此推测,二倍体桑树染色体加倍以后,植株抗逆性有可能增强。其研究结果,为该人工四倍体材料在桑树多倍体育种中的应用,提供了较好的参考价值。5.桑树果叶兼用四倍体与无性系二倍体亲本光合生理特性及光合结构的研究光合速率是决定作物产量的重要因素,本研究拟从光合生理特性及光合结构阐明该多倍体桑表现出产叶量和产果量高于无性系二倍体亲本的原因为目的。以前面实验获得的人工四倍体新品系及其无性系二倍体亲本为材料,用便携式Li-6400光合测定仪测定光合速率日变化、光响应曲线及CO₂-光合曲线;石蜡切片,显微镜观察输导组织即导管和筛管:通过电镜观察气孔结构及叶绿体内部结构等方面进行研究。实验结果表明,四倍体桑在4月中旬的日变化情况与二倍体相似,均呈双峰曲线,峰值都出现在上午11:00和下午16:00左右,而四倍体桑的Pn全天都高于无性系二倍体亲本。四倍体桑的表观量子效率较无性系二倍体亲本高,分别为0.069和0.05;四倍体桑的光饱和点略小于无性系二倍体亲本,分别为329μmol·m^-2·s^-1和339μmol·m^-2·s^-1;饱和光下四倍体桑的光合速率高于无性系二倍体亲本,分别为21.4μmol·m^-2CO₂·s^-1和15.7μmol·m^-2CO₂·s^-1;四倍体桑的呼吸速率较无性系二倍体亲本高,分别为1.26μmol·m^-2CO₂·s^-1和1.16μmol·m^-2CO₂·s^-1;四倍体桑的CO₂补偿点较无性系二倍体亲本低分别为60.56μmol·m^-2CO₂·s^-1和67.41μmol·m^-2CO₂·s^-1;四倍体桑的CO₂饱和点比无性系二倍体亲本的CO₂饱和点低,分别为800μmol·m^-2CO₂·s^-1和900μmol·m^-2CO₂·s^-1,在饱和CO₂下其同化速率分别为31.57μmol·m^-2CO₂·s^-1,和31.78μmol·m^-2CO₂·s^-1;四倍体桑的羧化效率（CE）较无性系二倍体亲本高,分别为0.096和0.067。这些实验结果表明,四倍体桑的光合性能较无性系二倍体亲本具有明显的优势。四倍体桑叶绿素含量显著高了二无性系二倍体亲本,四倍体桑的叶绿素a,叶绿素b两种色素的含量均较无性系二倍体亲本高,充分表明四倍体桑较二倍体桑能更好地适应或利用不同的光质成分,其光合能力也相应增强。四倍体桑的RuBP羧化活性极显著高于无性系二倍体亲本,这可能是四倍体桑的净光合速率高于二倍体桑的重要原因。四倍体桑与其无性系二倍体亲本的这些生理差异初步阐明了四倍体产叶量及产果量较无性系二倍体亲本高的生理机制。从桑叶叶片和茎段的解剖结构来看,人工四倍体新桑品系的气孔变大,叶绿体的长度和宽度都明显高于无性系二倍体亲本,表现出巨大性。叶绿体内部淀粉粒增大,数量减少,基粒片层和基质片层都很丰富,基粒片层厚,并且垛叠疏松,排列有序,有利于光合速率的提高。无性系二倍体亲本的淀粉粒多,基粒片层薄,垛叠紧密,不利于光合速率。因而,无性系二倍体亲本的Pn偏低,这可能与叶绿体的结构有关。另外,四倍体桑的输导组织也有一定的变异,导管增粗,导管数增加。这些结构变异构成了人工四倍体新桑品系产叶量高、产果量高的结构基础。