脑血管疾病是危害人类健康的三大疾病之一，其中缺血性脑血管病以其高发病率、高致残率和高死亡率而严重危害着人们的身体健康。脑缺血一旦发生，不仅缺氧和代谢障碍，同时毒性代谢产物蓄积而引起缺血性损伤，甚至细胞死亡。因此，早期再灌注对组织存活十分重要。但再灌注后产生的活性氧等又加重了细胞损伤，即再灌注损伤，促进了细胞的死亡。在缺血或再灌注损伤过程中，均可以引起受损神经元内出现一系列亚细胞和分子水平的病理变化，造成细胞膜、细胞器和DNA损伤，其中DNA损伤可能既是多种致伤因素作用的结果，也是细胞内产生新的变化和损伤的原因，研究表明DNA损伤引起的细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤的病理过程中占有十分重要的作用，成为缺血再灌注损伤引起凋亡的主要原因之一，也加重了再灌注引起的损伤。但神经元凋亡是一种可调控的细胞死亡方式，受到一系列蛋白质的调控。因此详细了解缺血再灌注损伤神经元的DNA的损伤情况，凋亡相关蛋白的表达和调控情况，可以为防止神经元凋亡提供有益的思路。目前研究最多的凋亡调控蛋白为Bcl-2家族蛋白，研究发现其促凋亡成员Bax、Noxa与DNA损伤引起的细胞凋亡有密切关系，但在神经元上尚未得到证明。本研究旨在探讨神经元类缺血再灌注损伤早期的DNA损伤形式，探讨参与凋亡的Bcl-2家族的促凋亡成员Bax和Noxa与神经元凋亡的关系，以明确缺血再灌注损伤机制，为缺血再灌注损伤的治疗提供依据。 本次实验采用小鼠大脑皮质神经元类缺血再灌注模型，将培养的皮质神经元分为未经缺血处理的对照组、再灌注0.5h、1h、2h、3h、6h、12h组，采用HE染色方法、DNA聚合酶-ⅠKlenow大片段介导的生物素标记的 第o宫医大学硕士管沾论支一dATP末端标记方法（Klenow法）、脱氧核糖核音酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）、流式细胞仪，免疫电镜等方法，观察各时间点损伤的神经元的形态学变化，检测DNA断裂损伤情况，检测BCI－2家族促凋亡成员Bax、Noxa表达变化情况，并初步观察＼oxa的转位情况。本次实验所得结果如下： （l）HE染色显示：光镜下观察，细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。末经缺血处理组神经元形态正常，胞趴 晰可见，冉灌注Zh损伤区域部分细胞出现形态变化，胞体皱缩或肿胀，随着缺血再灌注时间的延长，神经元胞体变小，胞质浓缩，核染色质；疑集，突起变短，变细，再灌注12h细胞数量明显减少。 （2）Klenow法检测显示：未经缺血处理的对照组神经元经过Kle。ow法染色后，平均灰度检测的结果为 72t4士 1t00，再灌注 Zh达高峰 135．5上1．31，而后又逐渐降低，12h阳性细胞己经明显减少。 （3）TUNEL法检测显示：未经缺血处理的对照组神经元经TUNEL法检测的阳性细胞比率情况为（10．5土 1．29）％，随着再灌注时间的延长，检测的阳性细胞比率明显增加，但在再灌注让 ，Zh和 3h时阳性细胞比率没有显著差别，在再灌注阳性细胞数达到高峰侣6．5士4．7幻％，再灌注12h阳性细胞数减少。 ＊Bax流式细胞仪检测结果显示：未经缺血处理的对照组神经元经流式细胞仪检测的阳性细胞比率情况为（1．6士0．07）％，随着再灌注时间的延长，检测的的阳性细胞比率明显增加，再灌注处理Zh 时阳性细胞数达到高峰门．1士0．20）％，达到未缺血组的6倍，再灌注3、6和12h阳性细胞数减少明显。 （5）Noxa流式细胞仪检测显示：未经缺血处理的对照组神经元经流式细胞仪检测的阳性细胞比率情况为（1．6士0．10）％，随着再灌注时间的延长，检测的的阳性细胞比率明显增加，再灌注lh 阳性细胞率达高峰 门0．6士0．53〕％，而后随着再灌注时间的延长阳性细胞数减少明显。12h与对照己经无显著差别。 ．6－ 第＠宫区夭管硕士管拄论支一 （6）免疫电镜观察 NOX3转位显示：未缺血组和缺血再灌注后 lh，神经元超微结构有明显的变化：对照组，线粒体形状完整，各种细胞器正常，再灌注后lh，一些线粒体可以看到膜增厚，有黑色颗粒样物质位于膜上。 本次实验结论如下： （1）根据 DNA聚合酶 IKlenow大片段的功能和原位杂交的原理，认为本实验中于再灌注Zh达到峰值的Klenow阳性细胞中多数应为DNA单链断裂的细胞。 ①首次在培养的小鼠皮质神经元类缺血再灌注模型上证明 mA单链断裂，且DNA单链断裂可能是队A早期损伤的形式之一，并认为DNA单链断裂可能是由自由基引发的一系列D＼A损伤过程中的一个重要环节。 m根据hx在类缺血再灌注不同时间点的表达情况，推测促凋亡蛋白Bax可能参与DNA损伤引起的神经元凋亡进程。 （4）首次在培养的小鼠皮质神经元缺血再灌注模型上证明促凋亡蛋白Mx。的存在，随着类缺血再灌注时问的不同，Mx。的表达有明显的变化，推测NOXd同样参与DNA损伤引起的神经元凋亡进程。 （5）在类缺血再灌注不同时间，＼oxa分别表达于细胞浆和线粒体外膜，可以认为hx?