Nodinhibit-1抑制角膜新生血管和炎症的实验研究

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目的:本文旨在通过研究潜在的促血管新生因子Nod1在角膜组织中的表达及其NOD1抑制剂Nodinhibit1在角膜新生血管和炎症的发生、预防和治疗机制,解决角膜术后免疫排斥反应的关键问题,发现治疗角膜新生血管的新途径。  方法:利用免疫组织化学的方法检测的Nod1在人类及不同鼠龄的小鼠角膜组织表达。体外实验以HUVEC和RAW264.7为研究对象,分别采用CCK8 assay和细胞划痕实验方法研究了Nodinhibit1对HUVEC的增殖和迁移能力影响,采用Dead和Live试验研究Nodinhibit1对RAW264.7影响。我们采用碱烧伤动物模型进行体内实验,预防试验:24只角膜碱烧伤大鼠随机分为2组(n=12,右眼),实验组给予10μg/ml Nodinhibit1滴眼液,另一组滴加磷酸盐缓冲液滴眼液(PBS),每日4次,连续14天。治疗试验:24只角膜碱烧伤10d后大鼠随机分为2组(n=12,右眼),实验组10μg/ml Nodinhibit1滴眼液滴眼,另一组PBS滴眼,每日4次,连续14天。术后不同时间点活体观察结膜充血、房水炎症反应、角膜新生血管、炎症及角膜上皮修复情况,并将碱烧伤角膜组织进行HE染色、免疫组化CD31染色、免疫荧光VEGF/PEDF染色、TUNEL染色以及Western blot检测。  结果:免疫组织化学结果显示,Nod-1表达于正常人体角膜上皮胞浆和少量基质细胞内表达,在出生后2周和8周的C57小鼠角膜上皮、基质层部分细胞和内皮细胞均有表达。Dead和Live试验发现10.0μg/ml Nodinhibit1较PBS能明显促进RAW264.7凋亡。CCK8和细胞划痕实验发现10.0μg/ml Nodinhibit1能明显抑制HUVEC的增殖和迁移。在预防和治疗实验中,10μg/mlNodinhibit1均可以有效的抑制和回退角膜新生血管,并能有效控制角膜炎症。此外,10.0μg/ml Nodinhibit1可以促进碱烧伤大鼠角膜上皮修复。TUNEL染色显示,10μg/mlNodinhibit1可以抑制碱烧伤大鼠角膜细胞的凋亡。HE染色表明角膜碱烧伤及碱烧伤10d后,连续使用10μg/mlNodinhibit1滴眼能使新生血管明显减少,炎症细胞降低。VEGF/PEDF荧光染色和Western blot检测发现与PBS点眼相比,角膜碱烧伤及碱烧伤10d后连续使用10μg/mlNodinhibit1滴眼均能使下调VEGF和上调PEDF的表达。CD31染色表明与PBS点眼相比,角膜碱烧伤后连续使用10μg/mlNodinhibit1滴眼能使CD31表达明显减少。  结论:Nod1在人类及不同鼠龄的小鼠角膜组织有表达。实验表明10μg/ml Nodinhibit1能很好的抑制和回退碱烧伤大鼠角膜新生血管。
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