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第一部分：MicroRNA-328在缺氧性肺动脉高压中的作用及机制研究
目的：MicroRNAs具有调控细胞分化、增殖、凋亡的功能，与心血管疾病密切相关。我们通过基因芯片技术筛选缺氧调控的microRNA，其中microRNA-328(miR-328)的下调明显，因此本研究旨在确定miR-328在缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH)中的作用及机制。
方法：1.构建缺氧大鼠模型，通过基因芯片技术确定缺氧对大鼠肺动脉血管中microRNAs表达的影响。2.以缺氧动物模型为基础，通过Real-timePCR(qRT-PCR)技术验证基因芯片的结果，并确定miR-328组织血管分布的特异性。3.利用原位杂交技术确定miR-328在肺动脉血管中的分布。4.通过对转基因小鼠右心室收缩压(Right Ventricular Systolic Pressures，RVSP)测定以及组织浴漕血管张力测定确定miR-328在缺氧性肺动脉血管收缩(Hypoxicpulmonary arterial vasoconstriction，HPV)中的作用，通过苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色法明确miR-328在缺氧性肺血管重构(Hypoxicpulmonary arterial vessel remodeling，HPVR)中的作用。5.构建过表达miR-328及AMO-328腺病毒载体感染的细胞模型，通过MTT、TUNEL、吖啶橙染色法、Western Blot技术等在细胞水平上确定miR-328对肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖或凋亡影响。6.通过数据库筛选，初步确定miR-328作用的和HPV及HPVR有关的靶蛋白。7.利用荧光素酶活力测定法确定miR-328作用的靶基因。8.利用qRT-PCR、Western Blot技术检测miR-328对靶基因转录和翻译的影响。
结果：1.基因芯片筛查结果显示，缺氧大鼠的肺动脉血管中11个microRNA的表达量变化2倍以上，其中3个下调，8个上调；2.qRT-PcR进一步验证了基因芯片结果，且miR-328主要分布于PASMCs中。3.miR-328能够影响肺动脉血管的收缩性，参与肺动脉血管的重构。4.MiR-328能够诱导PASMCs的凋亡。5。MiR-328能够抑制靶基因胰岛素生长因子I受体(Insulin growth factor Ireceptor，IGF-1R)以及L型钙通道alc亚基(CaV1.2)的蛋白表达，并且能够抑制IGF-1R的mRNA表达。6.荧光素酶活力测定实验表明，miR-328能够直接结合到靶基因IGF-1R和CaV1.2的3’-UTR区，引起荧光素酶活力降低。
结论：缺氧通过抑制miR-328上调CaV1.2、IGF1R的表达引起肺动脉血管收缩以及血管重构。
第二部分：15-羟基二十碳四烯酸抑制钾通道收缩肺动脉的机制研究
目的：确定15-脂氧酶/15-羟二十碳四烯酸(15-LO/15-HETE)是通过激活蛋白激酶C(PKC)信号途径抑制Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5的表达参与缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH)的发生。
方法：1.培养大鼠的肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth musclecells，PASMCs)，通过Western blot和RT-PCR技术确定缺氧不同时间对Kv3.4、Kv2.1表达的影响。2.通过CDC和NDGA阻断内源性15-LO/15-HETE的产生后，观察缺氧对PASMC中Kv3.4、Kv2.1表达的影响。3.确定5-HETE、12-HETE以及15-HETE对PASMC中Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5表达的影响。4.通过组织浴槽血管环张力测定，应用hypericin、KT5720分别阻断蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)、蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)后，观察15-HETE对血管收缩力的影响。5.应用hypericin阻断PKC后，观察15-HETE对Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5表达的影响。6.应用PMA激活PKC后，观察缺氧对Kv3.4、Kv2.1表达的影响。7.通过膜片钳(patch-clamp)技术确定15-HETE对Kv电流的影响，应用CDC、NDGA阻断15-LO/15-HETE，hypericin阻断PKC后，观察缺氧对Kv电流的影响。
结果：1.PASMCs暴露缺氧24小时后，Kv3.4的蛋白以及mRNA表达量明显下调，而Kv2.1的表达量没有明显变化。PASMCs暴露缺氧48小时后，Kv2.1的mRNA表达量降低，缺氧60个小时，PASMCs的Kv2.1的蛋白表达量明显减少。2。阻断内源性15-HETE产生后，缺氧对Kv3.4、Kv2.1表达的抑制作用明显减弱。3.15-HETE、12-HETE对Kv3.4、Kv2.1表达都有抑制作用，但15-HETE的抑制作用更强，5-HETE对Kv2.1表达的抑制作用很弱，对Kv3.4表达没有抑制作用。4.阻断PKC后能够明显缓解15-HETE、缺氧对肺动脉血管的收缩作用，阻断PKA后，并没有对缺氧诱导的肺血管收缩产生影响。5.阻断PKC后，15-HETE对Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5表达的抑制作用明显降低；阻断PKC后继续给予外源性15-HETE能够进一步降低Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5的表达。6.缺氧以及外源性15-HETE能够明显抑制Kv电流，阻断内源性15-HETE产生后能够明显缓解缺氧对Kv电流的抑制作用；阻断PKC后，缺氧对Kv电流的抑制作用减弱。
结论：15-HETE通过激活PKC信号通路抑制Kv3.4、Kv2.1、Kv1.5的表达，进而调控了缺氧肺动脉血管收缩(Hypoxic pulmonary arterialvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重构(Hypoxic pulmonary arterialvessel remodeling，HPVR)，从而参与HPH的发生。