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猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)引起的多种哺乳动物和部分鸟类共患的一种急性、发热性传染病;在猪群中呈暴发性流行,是危害全世界养猪业的重大传染病之一,可与其他多种病原混合感染,引起并发症。目前,许多研究表明多种病毒感染细胞后会引起热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)的差异表达变化,研究也表明HSPs参与多种病毒蛋白和病毒颗粒的合成,是帮助蛋白质折叠和聚集的重要分子伴侣,同时在抗原呈递中扮演着重要角色。在前期研究中,通过蛋白组学分析发现PRV感染PK-15细胞后,会导致细胞中部分HSPs的表达发生变化,但HSPs在PRV的感染中的作用还尚不清楚。本论文首先研究了PRV体外感染对宿主细胞增殖及细胞中HSP27、HSP70和HSP90表达的影响;并通过慢病毒干扰载体分别构建了HSP27、HSP70和HSP90稳定下调表达的PK-15细胞,进一步研究了HSPs下调表达后对PRV毒力、病毒在细胞中的复制和定位、细胞的增殖和凋亡以及部分抗病毒因子的表达的影响,初步探索了这三种HSPs对PRV的作用。所获得结果如下:1.采用iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测发现,PRV感染对PK-15细胞增殖的影响呈时间和浓度相关性,低病毒滴度在感染细胞后72 h内对PK-15细胞的增殖无显著影响,而高滴度感染则极显著抑制细胞的增殖;PRV感染细胞后,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现细胞中病毒核酸含量明显升高,在感染后60 h时达到较高水平;以10 TCID50处理PK-15细胞不同时间,通过RT-qPCR和免疫印迹试验(Western-blot)检测发现PRV感染早期可显著诱导细胞中HSP27、HSP70和HSP90的表达。2.通过构建shRNA-HSP27、shRNA-HSP70、shRNA-HSP90的慢病毒载体,转染包装细胞后获得相应的慢病毒,感染PK-15细胞后结合嘌呤霉素的筛选,通过RT-qPCR和WB的检测验证获得了HSP27、HSP70和HSP90稳定下调表达的PK-15细胞株。3.在HSP27、HSP70和HSP90稳定下调表达的PK-15细胞中:(1)用Reed-Muench法分别检测PRV感染后其病毒滴度在三种HSPs下调表达的细胞中均显著降低,PRV gE基因的表达也显著下降;(2)免疫细胞化学(ICC)检测显示PRV于感染后主要定位于细胞核,在三种HSPs干扰下调的细胞中PRV的荧光信号明显减弱;(3)PRV感染后,可在一定程度上抑制HSPs稳定下调细胞的增殖;(4)在三种HSPs下调的细胞中,凋亡相关因子Bax基因表达在PRV感染后各检测的时间点显著升高,而Bcl-2表达则呈下降趋势;(5)干扰下调三种HSPs的表达后,可在一定程度上促进细胞中抗病毒因子IFNα、Mx1和RNaseL的表达。以上结果表明,一定滴度的PRV病毒可显著抑制PK-15细胞的增殖,PRV感染可诱导PK-15细胞发生快速应答反应,使HSP27、HSP70和HSP90表达快速升高;当特异性干扰PK-15细胞中HSP27、HSP70和HSP90表达后,可在一定程度上抑制PRV的感染,这种抑制作用主要通过降低病毒滴度、抑制细胞的增殖、促进细胞凋亡和相关抗病毒因子的表达而实现。相关结果可为研发HSPs作为潜在的抗PRV药物提供理论依据。