研究背景随着高血压、糖尿病等这些慢性肾脏病(CKD)高危因素的慢性疾病在我国发病率的不断提高,我国大陆成年人群中的慢性肾脏病患病率为10.8%,总患病人数高达1.2亿人,慢性肾脏病已成为严重的公共卫生问题。同时,我国每年新进入终末期肾病的患者数量不断升高,如何延缓CKD的进展成为目前亟需解决的医学及社会问题。近年来大量的研究已经证明蛋白尿是的引起CKD患者肾小球滤过率(GFR)持续恶化的独立危险因素,CKD患者蛋白尿的水平将直接影响各种慢性肾脏疾病预后,所以降低蛋白尿具有重要的临床医学价值和意义。蛋白尿的病理生理基础是肾小球滤过屏障的结构和功能出现异常,对血液成分正常超滤作用受到损伤,血浆蛋白等大分子物质滤出并超过了肾小管重吸收功能,其中肾小球滤过屏障的结构和功能异常是重要的始动因素。肾小球滤过屏障由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)及足细胞组成,肾小球滤过屏障任何成分出现异常都会引起蛋白尿。既往对发生蛋白尿的机制主要集中在内皮细胞和肾小球基底膜,由于足细胞位于肾小球滤过屏障的外侧,解剖位置特殊,又由于在正常成年的机体中足细胞是终末分化细胞,在体外培养中足细胞的原代细胞不能增殖,使得针对足细胞的研究变得很困难。直到上世纪的90年代中期,人们使用转基因的方法培养建立了永生代小鼠足细胞系后,足细胞才能在体外培养,人们对足细胞的结构,功能,生理特点及在肾小球疾病中的作用机制的研究有了突破性的进展。足细胞即肾小囊脏层上皮细胞,在肾小球基底膜的外侧,由胞体、初级足突(FP)和次级足突构成,足细胞的足突呈指状交叉覆盖于肾小球基底膜的外侧,通过一些黏附分子和蛋白多糖分子与肾小球基底膜相连。足细胞是肾小球滤过屏障中的非常重要组成部分,其功能主要有:①对毛细血管襻起到支撑作用,对抗肾小球毛细血管内在的静水压,②维持肾小球基底膜的代谢平衡:分泌Ⅳ型胶原,纤维连接蛋白(FN)等肾小球基底膜中的主要成分;分泌基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶,这两种蛋白酶可以降解肾小球基底膜成分。③足细胞的足突呈指状交叉覆盖于肾小球基底膜的外侧,是肾小球滤过屏障中最后屏障。目前对足细胞的损伤的病理生理和相关的分子结构主要集中在以下几个区域:①顶端膜蛋白区域:主要包括Podocalyxin、GLEPP-1等分子;②维持足细胞形态的骨架蛋白:主要有synaptopodin、α-actinin-4及F-actin等分子,其中synaptopodin可以作为分化成熟足细胞的标志性蛋白;③与基底膜接触的基底蛋白区域:主要包括α3β1整合素、Dystroglycan (DG)等分子,这些分子表达异常可引起足细胞从基底膜脱落;④裂孔隔膜复合体(SDs)区域:主要包括P-cadherin、CD2AP、nephrin、podocin、ZO-1、FAT等分子,裂孔隔膜复合体的分子表达异常和蛋白尿产生关系密切,是目前研究的热点之一。目前尽管对足细胞分子结构和病理生理的认识有了很大进展,但人们对足细胞的损伤机制仍有很多不清楚,足细胞的损伤机制研究是目前肾内科关注最多的内容之一。足细胞的病变参与了大部分与蛋白尿相关的肾脏疾病的发生,并在疾病进展中起关键作用,阐明足细胞损伤的病理生理和发病机制具有重要意义。在多种表现为大量蛋白尿的肾脏疾病如微小病变型肾病(MCD)、糖尿病肾病(DN)、局灶性肾小球硬化(FSGS)、狼疮肾炎(LN)及膜性肾病(MM)中已证明足细胞损伤是疾病的始动因素或参与了疾病发生和发展的进程。足细胞损伤导致蛋白尿的产生的机制主要有两种:①如补体、免疫复合物、肾素血管紧张素、PAN、肾小球高灌注等损伤刺激的持续存在可导致足细胞脱落、凋亡,其它足细胞代偿性肥大。②脂多糖等损伤刺激因素诱导足细胞足突的骨架蛋白和动力系统改变,足细胞活动力增强,导致足突融合,从而引起蛋白尿。足细胞类似于神经元细胞,分化成熟,在成年人体中处于细胞周期的静止期,分裂增殖能力低下。既往针对足细胞损伤机制的研究主要集中于在嘌呤核苷、各种抗体、补体及血流动力学等因素持续刺激下导致的足细胞损伤后肥大、凋亡、脱落。由于人体中足细胞的再生能力非常低下,在足细胞脱落区域的肾小球基底膜裸露,其旁边的足细胞代偿肥大,足突进入裸露区域填补。当这种代偿机制失代偿时或者由于残存的肾小球代偿过度增生肥大时,代偿肥大的足细胞不能完全覆盖肾小球基底膜,这部分肾小球基底膜失去足细胞的支撑,由于肾小球毛细血管内由静水压的压迫,使得受压肾小球基底膜凸向肾小球的肾小囊,基底膜与肾小球的壁层上皮细胞接触、粘连,可以刺激壁层上皮细胞增生,导致细胞增生和细胞外基质成分沉积,从而最终导致肾小球硬化,从而引起蛋白尿和慢性肾脏疾病进展。最近研究发现:受到损伤因素刺激的足细胞表现与肿瘤细胞相似,表现为一种高动力细胞;例如受到脂多糖等刺激后足细胞在体外实验中活动力增强,表现为迁移能力增强,在体内的研究中发现足细胞受到刺激后表现为足突骨架蛋白表达变化,动力系统改变,在电镜下表现为足突融合,在体内这种异常增高的活动力引起蛋白尿的产生。在人类肾小球疾病、PAN诱导足细胞损伤肾病动物模型以及LPS诱导的短暂蛋白尿小鼠模型及LPS诱导的足细胞模型中,受到损失因素刺激的足细胞尿激酶受体(urokinase receptor,uPAR)表达增加,可引起足细胞活动力增强,足突融合和导致蛋白尿的发生。uPAR是糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白中的一种,主要在炎症细胞、肿瘤细胞中表达。uPAR通过和与细胞表面的整合素、小窝蛋白等跨膜蛋白结合,从而形成信号传导复合体,在炎症细胞的迁徙,肿瘤细胞的浸润及转移等生物学效应中起着重要作用。目前已经发现在肾脏中,uPAR除在肾小管细胞中表达外,在足细胞中也有表达。最新的研究发现给于足细胞脂多糖刺激后,可诱导足细胞的uPAR表达升高;而在肾小球足细胞特异敲除uPAR基因(PLAUR)小鼠中,即使给于脂多糖刺激,小鼠的尿蛋白不升高;在敲除uPAR基因小鼠中重新转入uPAR基因,尿蛋白重新升高。同时在体外的试验中也证实敲除uPAR基因使足细胞活动力减弱,转入uPAR基因使足细胞活动力增强,者证明了 uPAR蛋白表达升高可以诱导足细胞活动力增强,在体内表现为细胞融合和蛋白尿发生。最新研究也已经证实在人体和动物试验中循环uPAR (SuPAR)的升高在是局灶节段性肾小球硬化性肾小球肾炎发生的关键因素。我们课题组的既往研究也证实了阿米洛利作为一种Na通道阻滞剂的利尿药剂,在克隆的肿瘤细胞株中可以抑制uPAR表达。在5/6肾切除大鼠动物模型、脂多糖诱导的短暂蛋白尿小鼠的动物模型和体外脂多糖刺激的足细胞模型中,阿米洛利可以抑制uPAR表达,降低足细胞活动力,降低蛋白尿。这些最新的研究提示了足细胞中的uPAR作为一种活动力相关因子,与足细胞损伤的机制密切相关,uPAR蛋白可能成为将来治疗蛋白尿的新靶点。维生素D是一种维持钙磷代谢及骨骼结构的前类固醇激素。维生素D3经体内合成或经食物吸收后首先在肝脏的羟基化酶的作用下,维生素D3发生侧链的25位羟基化,之后又在肾脏的羟基化酶的作用下,使得A环的1位羟基化,维生素D3转化为活性维生素D3(1,25 (OH) 2D3)。1,25 (OH) 2D3是维生素D3在体内起作用的活性形式,经典作用是维持钙磷代谢及骨骼结构。但是随着研究的深入,人们逐渐认识到它除了调节钙磷代谢外,还具有有抗增殖、抗分化、抑制RAS、调节细胞凋亡、抗炎、介导免疫反应等更广泛的生理作用。1,25 (OH) 2D3的生物学效应由维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)介导。维生素D受体为膜受体(membrane vitamin D receptor,mVDR)及核受体(nucler vitamin D receplor,nVDR)。mVDR主要功能是参与调节体内钙磷平衡。nVDR则调节靶基因表达,控制相对应蛋白质合成。维生素D受体广泛表达在各种细胞中,同样在足细胞中也有表达。1,25(OH)2D3进入细胞核内,和nVDR结合从而活化VDR,与1,25(OH)2D3结合后的nVDR产生了构象的改变,和视网膜X受体(retinoid X receptor,RXR)结合后形成异二聚体,而VDR -RXR复合物可以结合位于靶基因的5’端上游的维生素D反应元件,从而激活靶基因的转录。1,25(OH)2D3通过VDR介导调节相应蛋白,从而发挥有抗增殖、抗分化、抑制RAS、调节细胞凋亡、抗炎、介导免疫反应等广泛的生理作用。1,25 (OH) 2D3是由肾脏主要分泌的内分泌激素之一,目前人们越来越关注1,25(OH)2D3在其传统的调节钙磷和骨质代谢之外的肾脏保护作用。慢性肾脏病患者在早期也可能存在活性维生素D不足,研究发现在早期补充1,25(OH)2D3具有降低蛋白尿,延缓肾脏疾病进展的肾脏保护作用,这已经通过近年来的一些临床和动物实验证实。临床研究资料显示,对IgA肾病患者、慢性肾脏病3-4期患者、糖尿病肾病患者、尚未透析的慢性肾脏病4-5期患者,补充1,25(OH)2D3或其它的活性维生素D3都具有减少尿蛋白的作用。在体内动物模型实验中证实在5/6肾切除大鼠动物模型中,在anti-Thy-1.1诱发的急进性肾小球肾炎大鼠动物模型中,在嘌呤霉素氨基核苷酸(PAN)诱导足细胞损伤的大鼠动物模型中,在Heymann大鼠模型中及糖尿病肾病小鼠模型中,1,25(OH)2D3或其它的活性维生素D3具有减少尿蛋白的作用。我们课题组的既往研究也证实1,25(OH)2D3可以降低PAN诱导足细胞损伤的大鼠蛋白尿。相反,在VDR基因敲除的糖尿病模型的小鼠蛋白尿明显增加。但1,25(OH)2D3降尿蛋白的机制目前尚不完全明确。1,25(OH)2D3对肾脏组织的不同细胞都具有生物学效应,早期的研究主要集中1,25(OH)2D3作用于系膜细胞,1,25(OH)2D3可以抑制系膜细胞的过度增殖,减轻系膜基质过度产生和沉积;也有研究证实1,25(OH)2D3可以抑制肾脏间质的成纤维细胞转分化,从而减轻肾脏间质纤维化。然而,近年来许多研究证实足细胞是1,25(OH)2D3发挥肾脏保护作用的另外一个靶细胞。既往已经在anti-Thy-1.1诱发的急进性肾小球肾炎大鼠动物模型、5/6肾切除大鼠动物模型等发现1,25(OH)2D3可以起到保护足细胞的作用,我们课题组既往已经证实在嘌呤霉素氨基核苷酸的大鼠动物模型中1,25(OH)2D3能有效的抑制PAN诱导的足细胞凋亡,减轻蛋白尿,其机制可能是1,25(OH)2D3通过调剂TGFβ1/ BMP-7信号通路以及调节PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase)/Akt信号通路,从而减少足细胞凋亡,减少蛋白尿。既往这些研究主要关注1,25(OH)2D3保护足细胞的机制是通过调剂以下的几个信号通路如足细胞内TGFβ1/BMP-7信号通路、足细胞内PI3K/Akt信号通路、肾脏局部RAS (local renin-angiotensin system)系统激活等机制,从而维持足细胞nephrin蛋白表达,诱导足细胞的分化,减少足细胞的凋亡,减少蛋白尿。但是目前尚没有1,25(OH)2D3调节足细胞活动力的研究。而在乳腺肿瘤细胞,皮肤肿瘤细胞中,既往研究发现1,25(OH)2D3可以抑制细胞uPAR表达,减弱细胞的活动力,抑制肿瘤迁移能力,减少肿瘤细胞的侵润和转移[10]。这种现象提示1,25(OH)2D3也能抑制足细胞的uPAR表达。我们假设1,25(OH)2D3可能通过抑制uPAR的表达,抑制足细胞活动力,减轻足细胞足突的融合,减少蛋白尿。为验证假设,本研究在5/6肾切除大鼠模型和LPS诱导的小鼠短暂蛋白尿模型以及体外实验中给予1,25(OH)2D3干预,发现体内1,25(OH)2D3可以减轻足细胞足突融合,减轻肾小球硬化,减轻蛋白尿,同时发现1,25(OH)2D3也可以抑制足细胞uPAR异常的高表达;在体外实验中我们也证实1,25(OH)2D3可以抑制足细胞uPAR的异常高表达,减弱损伤足细胞的活动力。这些现象证实1,25(OH)2D3可以抑制足细胞uPAR的表达和降蛋白尿的现象,提示1,25(OH)2D3通过抑制uPAR的表达,抑制足细胞活动力,减轻足细胞足突的融合,减少蛋白尿。研究方法一、建立5/6肾切除大鼠模型蛋白尿模型,观察1,25(OH)2D3对蛋白尿、肾小球硬化及uPAR表达的影响(一)5/6肾切除大鼠模型的制作:42只SD雄性大鼠,编号后通过随机表法随机分为3组,每组14只:即假手术组(Sham组)、5/6肾切除组(NTX)、5/6肾切除+1,25(OH)2D3干预组(NTX+1,25(OH)2D3),其中5/6肾切除+1,25(OH)2D3干预组组在术后1周有1只大鼠死亡。使用橄榄油稀释 1,25(OH)2D3 为 0.5ug/ml, NTX 和 NTX+1,25(OH)2D3 组行 5/6肾切除手术,一周后每日给予1,25(OH)2D3 0.3ug/kg/day灌胃,NTX组一周后每日按体重给于橄榄油0.6ml/kg/day灌胃;Sham组行假手术,一周后每日按体重给于橄榄油0.6ml/kg/day的橄榄油灌胃。(二)5/6肾切除大鼠模型分别于2周、4周、8周、12周随机选取5只大鼠留取24小时尿液检测尿蛋白量。在第2周Sham组和NTX组每组处死3只大鼠,NTX+1,25(OH)2D3组处死2只大鼠留取肾组织,第4周、8周每组处死3只大鼠并取肾组织。(三)第12周大鼠处死后行厚度为3微米肾组织冰冻切片,放入-80℃冰箱冻存备用。使用双重免疫荧光染色后放4℃冰箱暗盒内保存,2天内使用共聚焦激光显微镜观察uPAR蛋白和synaptopodin蛋白的表达。第12周大鼠肾组织放入10%甲醛溶液内浸泡,后行石蜡包埋备用。之后行厚度为3微米肾组织石蜡切片,通过PAS染色(Periodic Acid-Schiff stain)观察肾小球硬化,每组随机评估60个肾小球评价肾小球硬化指数,评估不同组肾小球硬化的程度。(四)大鼠处死后肾脏皮质放入液氮保存。之后提取第12周大鼠肾脏组织皮质的mRNA及蛋白,使用real-time PCR检测大鼠皮质plaur mRNA表达,Western Blot检测大鼠皮质uPAR蛋白表达。二、建立脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型,观察1,25(OH)2D3对蛋白尿、足突融合及uPAR表达的影响(一)脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型制作:32只C57BL/6雄性小鼠,编号后通过随机表法随机分为4组,每组8只分为正常对照组(Con组)、LPS处理组(LPS组)、1,25(OH)2D3处理组(1,25(OH)2D3组)、LPS 与 1,25(OH)2D3 共同处理组(LPS+1,25(OH)2D3 组)。使用无菌生理盐水稀释LPS浓度为500 ug /ml,LPS组及LPS+1,25 (OH)2D3 组腹腔注射 LPS 300ug(第一天 200ug,第二天 100ug),Con 组及 1,25(OH)2D3组给予等量生理盐水(第一天0.4ml,第二天0.2ml)腹腔注射。使用橄榄油稀释 1,25(OH)2D3 为 0.5ug/ml。1,25(OH)2D3 组及 LPS+1,25 (OH)2D3组提前二天给予1,25 (OH) 2D3 2.5μg/kg/day灌胃,Con组及LPS组每天给予5ml/kg/day橄榄油灌胃。(二)于第3天使用小鼠代谢笼留取24小时尿液,检测尿蛋白肌酐比值。之后处死小鼠并留取肾组织。(三)小鼠肾组织行厚度为3微米冰冻切片,放入-80℃冰箱冻存备用。使用双重免疫荧光染色后放4℃C冰箱暗盒内保存,2天内使用共聚焦激光显微镜观察uPAR蛋白和synaptopodin蛋白的表达。处死小鼠后立即小鼠肾皮质组织切成1mm3的组织块放入戊二醛内浸泡,之后使用电镜观察各组足细胞足突变化。(四)小鼠处死后肾脏皮质放入液氮保存,之后提取小鼠肾脏皮质组织的mRNA及蛋白,使用real-time PCR检测小鼠肾脏皮质plaur mRNA表达,Western Blot检测小鼠肾脏皮质uPAR蛋白表达。三、1,25(OH)2D3对足细胞uPAR表达的影响(一) 足细胞培养:由美国Baylor医学院Danesh教授惠赠的条件永生小鼠足细胞系。使用Ⅰ型胶原包被的培养瓶。5%CO2, 33℃培养箱环境下,使用加入20-100U· mL-1 IFN-γ的RPMI 1640+10% FBS培养液中培养,足细胞有增殖能力。在5% CO. 37℃培养箱环境下,用DMEM加10% FBS (不含IFN-y)培养液培养,足细胞增殖能力消失,进入分化阶段。经10-14天37℃的诱导培养,足细胞分化成熟。(二)足细胞形态学观察及鉴定:使用相差显微镜直接观察IFN-γ培养液的33℃培养的足细胞,已及不含IFN-γ培养液的37℃诱导分化10-14天的足细胞,观察其形态学差异并拍照。由于足细胞骨架蛋白synaptopodin是分化成熟的足细胞的特异标志分子,免疫荧光染色,使用荧光显微镜观察synaptopodin的表达。表达synaptopodin蛋白的细胞为分化成熟的足细胞。(三)足细胞的分组:每批分化10-14天的分化成熟足细胞分为4组。按照对足细胞不同干预处理分为:①正常对照组(Con组):不加任何干预因素;②1,25(OH)2D3组(1,25(OH)2D3组):加入 1 nmol/L的1,25(OH)2D3与分化成熟足细胞共孵育24h;③LPS组(LPS组):加入50·mg.L-1的LPS与分化成熟足细胞共孵育24h;④LPS+1,25(OH)2D3 处理组(LPS+1,25(OH)2D3 组):用 50·mg·L-1 的 LPS 和 1 nmol/L的1,25(OH)2D3与分化成熟足细胞共孵育24h;(四)观察1,25(OH)2D3对足细胞plaur mRNA表达水平的影响:细胞干预24小时后,立即提取各组的足细胞mRNA,使用real-time PCR检测各组足细胞plaur mRNA表达水平。(五)观察1,25(OH)2D3对足细胞uPAR蛋白表达水平的影响:①通过流式细胞术不同组uPAR蛋白在足细胞表达阳性率的差异;②免疫荧光染色uPAR蛋白,使用共聚焦荧光显微镜检测Con组、1,25(OH)2D3组、LPS 组及 LPS+1,25(OH)2D3)组 uPAR 蛋白表达;四、观察1,25(OH)2D3对足细胞活动力的影响(一)转板迁移测定法(Transwell migration assay):使用龙胆紫染色,在倒置显微镜下观察并摄片,观察Con组、LPS组、1,25(OH)2D3组及LPS+1,25(OH)2D3)组足细胞迁移能力的差异。(二)刮除法(Wound healing assay):在Ⅰ型胶原包被的六孔板爬片上培养细胞后,刮除细胞后给予不同的处理,观察Con组、LPS组、1,25(OH)2D3组及LPS+1,25(OH)2D3)组足细胞迁移能力的差异。五统计学处理本研究的数据应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有计量资料数据都以均数±标准差(x±s)表达,使用单因素方差分析(One-way ANOVA)统计分析数据,使用Levene检验方差齐性,方差齐性数据使用LSD法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P< 0.05被定为有统计学差异。结果一、1,25(OH)2D3可以降低5/6肾切除大鼠蛋白尿模型中的蛋白尿和抑制肾小球硬化。(一)5/6肾切除大鼠蛋白尿模型各组尿蛋白变化:第2周时,与Sham组比较,NTX组的24小时尿蛋白明显升高[(47.50±28.05) mg vs (14.28±3.8) mg, P =0.011 ],有统计学意义;与 NTX组相比,NTX+1,25(OH)2D3组尿蛋白无统计学意义(49.41±10.32) mg vs(47.50±28.05)mg,p=0.865。第 4 周时,NTX 组与 Sham 组及 NTX+1,25(OH)2D3组相比较,NTX组较Sham组尿蛋白无明显升高(50.09±22.34) mg vs(21.77±5.29) mg,p=0.084; NTX 组与 NTX+1,25(OH)2D3 组尿蛋白无明显差异(50.09±22.34) mgvs (59.70±34.21) mg, p =0.535。第 8 周时,与 NTX 组尿蛋白(162.39±27.62) mg 相比,NTX+ 1,25(OH)2D3 组尿蛋白(72.41±27.47)mg和sham组(19.38±8.26) mg尿蛋白均明显较低,p值分别是0.024、0.004,有统计学意义。第12周时,与sham组尿蛋白(21.32±8.59) mg相比,NTX组尿蛋白(188.31 ±29.82) mg 明显升高,p 值 0.000; NTX+1,25(OH)2D3 组尿蛋白(131.93±71.04) mg 与 NTX 组尿蛋白(188.31±29.82) mg 相比,24 小时尿蛋白有下降的趋势。第2周开始,NTX组和NTX+1,25(OH)2D3组的蛋白尿水平较假手术组蛋白尿升高。但从第8周开始NTX组蛋白尿较低4周显著升高。而予1,25(OH)2D3干预的NTX+1,25(OH)2D3组大鼠的蛋白尿水平较NTX组蛋白尿升高的水平明显缓解;但到12周时尽管NTX+1,25(OH)2D3组仍比NTX组蛋白尿水平降低,但已经没有底8周时显著。这说明①1,25(OH)2D3可以降低NTX大鼠的蛋白尿;②在第8周时1,25(OH)2D3降低NTX大鼠的蛋白尿最明显,而到12周时2组间的差异减少。这可能因为即使1,25(OH)2D3可能降尿蛋白,但随着大鼠病情的持续恶化,到疾病到终末期时即使有1,25(OH)2D3的保护作用,残存的肾脏也会发生失代偿。1,25(OH)2D3可以降低蛋白水平,延缓疾病的进展,但不能阻止疾病的进展。(二)1,25(OH)2D3抑制SD大鼠5/6肾切除模型各组肾小球硬化的差异:与Sham组,NTX组的肾小球硬化指数明显升高(0.150±0.360 )vs( 1.900±0.699),p =0.000, NTX+1,25(OH)2D3较NTX组的肾小球硬化指数明显明显下降(1.350±0.577) vs (1.900±0.090),p=0.000。这些数据证明 1,25(OH)2D3 可以抑制5/6肾切除大鼠的肾小球硬化。二、1,25(OH)2D3对5/6肾切除大鼠蛋白尿模型uPAR表达的影响(一)使用激光共聚焦显微镜观察双重免疫荧光染色的大鼠肾脏组织:Synaptopodin (绿色荧光)是足细胞特异性骨架蛋白,可以用来位足细胞。与Sham相比较,NTX组的uPAR (红色荧光)表达增加,荧光亮度较高,在Merge中表现为黄色;给于1,25(OH)2D3干预后,发现NTX+1,25(OH)2D3组与NTX组相比,标志uPAR的红色荧光强度明显下调,Merge中黄色亮度明显下降。免疫激光共聚焦检测提示①在肾小球中uPAR表达定位于足细胞;②1,25(OH)2D3可以降低5/6肾切除大鼠足细胞uPAR蛋白表达。(二)使用Real-time PCR检测不同组大鼠皮质PLAUR mRNA表达差异:与Sham组相比较,NTX组的PLAUR mRNA表达明显增高(2.438±0.414vs 1.00±0.00, p=0.000);与 NTX 组相比较,NTX+1,25(OH)2D3 的 PLAUR mRNA表达明显增高明显下降 1.643±0.429vs2.438±0.414,p=0.006。这提示 1,25(OH)2D3可以抑制5/6肾切除大鼠肾脏皮质的PLAUR mRNA表达。(三)使用Western Blot检测不同组大鼠皮质uPAR蛋白表达差异:与sham组相比较,Western blot显NTX组uPAR表达明显增高(1.498±0.184 vs1.00±0.00, p=0.010);与 NTX 组相比较,NTX+1,25(OH)2D3 组 uPAR 表达有下降趋势(1.498±0.184vs1.322±0.126)。三、1,25(OH)2D3可以降低脂多糖诱导小鼠蛋白尿和抑制足细胞足突融合(一)脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型各组尿蛋白肌酐比值的变化:Con组与LPS组相比较,LPS组尿蛋白肌酐比值明显升高(72.00±35.62)ug/mg vs (732.88±233.21) ug/mg, p=0.000;而 LPS+1,25(OH)2D3 组与 LPS 组相比较,LPS+1,25(OH)2D3组蛋白肌酐比值明显降低[(322.81±80.74) ug/mgvs(732.88±233.21) ug/mg,p=0.000; 1,25(OH)2D3 组与 Con 组相比无统计学意义[(74.16±26.18) ug/mg vs (72.00±35.62) ug/mg, p=1.000。证明 1,25(OH)2D3可以降低LPS诱导的小鼠蛋白尿。(二)脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型各组足细胞足突融合情况差异:Con组和1,25(OH)2D3组足细胞足突无明显融合,LPS组足细胞足突广泛融合;与LPS组比较,LPS+1,25(OH)2D3组足细胞足突融合明显减轻。证明1,25(OH)2D3可以减轻LPS诱导的小鼠足细胞的足突融合。四、1,25(OH)2D3抑制LPS诱导小鼠足细胞uPAR表达(一)使用激光共聚焦显微镜观察双重免疫荧光染色的小鼠肾脏组织:Synaptopodin (绿色荧光)是足细胞特异性骨架蛋白,可以用来位足细胞。在LPS小鼠模型上,Con组uPAR (红色荧光)广泛存在于肾小管,但在肾小球表达很少,Merge显示Synaptopodin和uPAR很少在肾小球足细胞上融合;而LPS组可见在肾小球uPAR表达增加,荧光亮度升高,Merge显示uPAR和Synaptopodin融合成黄色荧光,黄色荧光亮度升高;在LPS+1,25(OH)2D3组明显可见黄色荧光uPAR荧光亮度降低,Merge显示黄色荧光亮度较LPS组明显下降;Con组和1,25(OH)2D3组的uPAR和Synaptopodin的荧光亮度无差别。这提示1,25(OH)2D3可以降低LPS诱导的小鼠肾脏足细胞uPAR蛋白表达。(二)使用Real-time PCR检测不同组小鼠皮质PLAUR mRNA表达差异:LPS组与Con组相比较,LPS组小鼠皮质PLAUR mRNA表达明显增高(2.660± 1.042 vs 1.000±0.000),p=0.000; LPS+1,25(OH)2D3 组与 LPS 组相比较,LPS+1,25(OH)2D3 组的 PLAUR mRNA 表达明显下降(1.765±0.250 vs 2.660±1.042),p=0.009; 1,25(OH)2D3 组与 Con 组 PLAUR mRNA 表达无差异(1.042±0.212 vs1.000±0.000), p=0.980。(三)使用Western blot检测不同组小鼠皮质uPAR蛋白表达差异:在LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型上,Western blot显示,LPS组与Con组相比较,LPS 组 uPAR 蛋白表达明显增高,2.157±0.384vs1.000±0.000),P=0.000;LPS+1,25(OH)2D3 组与 LPS 组相比较,LPS+1,25(OH)2D3 组 uPAR 蛋白表达明显下降(1.630±0.236 vs 2.157±0.384),P=0.000; 1,25(OH)2D3 组与 Con 组 uPAR蛋白表达无差异(0.967±0.122vs 1.000±0.000),P=0.980。五、1,25(OH)2D3对足细胞uPAR表达的影响(一)利用激光共聚焦显微镜观察各组组足细胞uPAR蛋白表达:LPS组uPAR蛋白(红色荧光)荧光亮度明显强于Con组、1,25(OH)2D3组和 LPS+1,25(OH)2D3 组;而 Con 组与 1,25(OH)2D3 组及 LPS+1,25(OH)2D3组荧光信号无明显差异。说明在体外1,25(OH)2D3可以抑制LPS诱导的uPAR蛋白表达。(二)使用Real-time PCR检测各组足细胞PLAUR mRNA表达差异:LPS组与Con组相比较,LPS组足细胞plaur mRNA的表达水平较Con组升高趋势(2.246±1.043 vs 1.00±0.00) , p=0.058; LPS+1,25(OH)2D3 组较 LPS组plaur mRNA表达水平有下降趋势(1.464±0.376vs 2.246±1.043),p=0.334。提示在体外1,25(OH)2D3可以抑制LPS诱导的足细胞PLAUR mRNA表达。(三)利用流式细胞术检测各组足细胞uPAR蛋白表达阳性率的差异:Con 组、1,25(OH)2D3 组、LPS 组及 LPS+1,25(OH)2D3 组 uPAR 蛋白表达率分别为(9.800±3.112)%, (11.180±2.255)%,(54.660±8.685)%及(28.900±4.456)%; LPS组uPAR蛋白表达率明显高于Con组(P=).001)及LPS+1,25(OH)2D3组(P=0.005) ; Con组和1,25(OH)2D3组uPAR蛋白表达率无差异。证明在体外1,25(OH)2D3可以抑制LPS诱导的uPAR蛋白表达。六、1,25(OH)2D3对各组足细胞活动力的影响(一)转板迁移测定法(Transwellmigration assay):在 Con 组、1,25(OH)2D3 组、LPS 组及 LPS +1,25(OH)2D3 组,平均每个视野细胞数分别为(8.40±3.7)、(9.3±2.7)、(31.3±7.9)和(19.2±6.8)个,LPS组高于其他3组,有统计学意义(均P<0.05)。(二)划痕法 Wound healing assay):在Con组、1,25(OH)2D3组、LPS组及LPS +1,25(OH)2D3组细胞数分别为(14.8±4.2)、(15.0±4.2)、(28.2±7.5)和(18.1±6.3)个,LPS 组均高于其它三组(均P P=0.000)。转板迁移测定法和划痕法实验证明了 LPS刺激后足细胞迁徙能力明显升高,给于1,25(OH)2D3干预后能抑制足细胞这种异常增高的迁徙力,说明1,25(OH)2D3可以抑制足细胞异常升高的活动力。结论一、在体内5/6肾切除大鼠蛋白尿模型中,1,25(OH)2D3可以降低模型大鼠的蛋白尿,减轻肾小球硬化;同时1,25(OH)2D3可以mRNA和蛋白两个水平都抑制在uPAR表达;二、在在体内制LPS诱导小鼠蛋白尿模型中,1,25(OH)2D3可以降低LPS诱导小鼠蛋白尿水平,减轻小鼠足细胞足突的融合;同时1,25(OH)2D3可以mRNA和蛋白两个水平都抑制在uPAR表达;三、在体外LPS诱导足细胞损伤模型中,1,25(OH)2D3可以在mRNA水平和蛋白水平抑制uPAR表达;1,25(OH)2D3可以降低足细胞活动力;本研究结果首次证明1,25(OH)2D3可以抑制足细胞uPAR表达,减弱足细胞活动力,减轻足细胞足突的融合和肾小球硬化,降低蛋白尿。