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目的:
探讨实验性肺纤维化病理过程中基质金属蛋白酶与中性细细胞弹力蛋白酶的活性变化及其调控特点;扶正化瘀方对肺纤维化大鼠肺泡炎与纤维化的不同病理阶段的作用;扶正化瘀方通过调节基质金属蛋白酶与中性细细胞弹力蛋白酶活性及肺组织细胞外基质代谢而抗肺纤维化的作用机制。
方法:
1肺纤维化模型制备与动态病理观察分组SD大鼠48只,随机分为模型组(30只)与正常组(18只),模型组以8mg/kg大鼠体重的剂量,一次性气管内注射博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型,正常组注入等量生理盐水,每组再随机分为染毒后1d、3d、1w、2w、3w与4w共6个时间观察点,其中,模型组每个时间观察点5只大鼠,正常组每个时间观察点3只大鼠。
2肺泡炎与肺纤维化模型制备、分组与用药大鼠同上方法注射博来霉素,染毒2w后为肺泡炎模型,染毒4w后为肺纤维化模型。
肺泡炎模型大鼠36只,分模型对照组、扶正化瘀方组、甲强龙组,每组12只,另设正常对照组6只。扶正化瘀方组予以4.6g/kg大鼠体重的扶正化瘀方灌胃;甲强龙组予以15mg/kg大鼠体重的甲强龙腹腔注射(均相当于65kg成人等体重用量的10倍量),正常组和模型组以等量生理盐水灌胃;每日1次,自造模之日起,直至造模2w末。
肺纤维化模型大鼠36只,同上分为模型对照组、扶正化瘀方组、甲强龙组,每组12只,另设正常对照组6只。同上方法与剂量给药,自造模之日起,直至造模4w末。
3主要观察指标称重与计算大鼠肺系数(两肺湿重/体重),HE染色观察肺组织炎症病理,Masson染色观察肺组织胶原沉积,透射电镜观察肺组织超微病理,Jamall氏法检测肺组织羟脯氨酸含量,RealTime-PCR检测肺组织TNF-α基因表达,Western印迹法分析肺组织α-SMA与Ⅰ、Ⅳ型胶原的蛋白表达、Western印迹法与免疫组化染色分析MMP-2/9与TIMP-1/2的蛋白表达,免疫组化染色分析肺组织弹力蛋白、NE、α1-AT的蛋白表达。明胶酶图法检测肺组织MMP-2/9活性,底物法检测肺组织NE活性;弹力蛋白板法检测血清NE活性。
结果:
1染毒2w时,以肺泡炎症病变为主,表现为:肺组织呈局灶性病变,肺泡腔与间质内大量炎细胞浸润,伴有少量成纤维细胞,胶原沉积不明显。肺系数与肺组织TNF-α基因表达显著增加。肺组织α-SMA、Ⅰ/Ⅳ型胶原明显增加;Hyp含量无明显增加。TIMP-1/2蛋白表达无明显增加;而MMP-2/9蛋白表达逐渐增加,其活性则明显升高,以活化型MMP-2升高更为显著。肺组织弹力蛋白表达增加不明显;NE蛋白表达增加明显,肺组织NE活性与血清NE活性明显升高,以3d时最为明显;α1-AT蛋白表达无明显变化。
2染毒4w时,以肺纤维化病变为主,表现为:肺泡结构破坏,部分肺泡腔塌陷消失,由胶原纤维和成纤维细胞占据,肺泡壁与间隔进一步增厚,形成明显的纤维化。肺系数较2w时有所下降,但仍高于正常。肺组织TNF-α基因表达明显下降。肺组织α-SMA、Ⅰ/Ⅳ型胶原和Hyp含量显著增高。MMP-2/9与TIMP-1/2蛋白表达均明显增加,而MMP-2/9及活化型MMP-2活性较2w时有所下降,至4W时MMP-2活性仍高于正常,而MMP-9活性低于正常。肺组织弹力蛋白表达明显增加;NE蛋白表达明显减少,肺组织与血清NE活性均明显下降;肺组织α1-AT蛋白表达明显增加。
3扶正化瘀方对肺泡炎症的影响与模型对照组比较,扶正化瘀方组与甲强龙组大鼠肺组织炎性细胞浸润、肺泡结构破坏明显减轻。肺系数与肺组织TNF-α基因表达明显下降。肺组织α-SMA与Ⅰ/Ⅳ型胶原蛋白表达明显减少,尤以扶正化瘀方组作用显著。MMP-2/9蛋白表达有所减少,MMP-2/9活性与活化型MMP-2活性均明显下降,扶正化瘀方组下降优于甲强龙组。肺组织弹力蛋白表达有所减少,肺组织NE活性升高,以甲强龙组升高明显;血清NE活性均明显升高。α1-AT蛋白表达均明显减少。
4扶正化瘀方对肺纤维化的影响与模型对照组比较,扶正化瘀方组与甲强龙组肺组织纤维细胞明显减少,胶原沉积明显减轻。肺组织α-SMA、Ⅰ/Ⅳ型胶原蛋白表达与肺组织Hyp含量均明显减少,扶正化瘀方组减少尤其显著。MMP-2/9与TIMP-1/2蛋白表达明显减少,MMP-2活性与活化型MMP-2活性均明显下降,而MMP-9活性有所升高。肺组织弹力蛋白表达明显减少,肺组织NE蛋白表达无明显变化,肺组织与血清NE活性明显升高,α1-AT蛋白表达明显减少。
结论:
1中性粒细胞丝氨酸弹力蛋白酶(NE)与基质金属蛋白酶(MMPs)在肺纤维化形成过程中有一定的变化特点:早期炎症阶段,肺组织和血清NE活性与肺组织MMP-2/9活性增高,肺组织弹力蛋白减少,基质破坏;后期纤维化阶段肺组织α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)与TIMP-1/2表达增加,抑制肺组织和血清NE及肺组织MMP-2/9活性,肺组织弹力蛋白等ECM降解减少,生成与沉积增加,最终形成肺纤维化。
2扶正化瘀方对实验性肺泡炎症和纤维化均有良好的干预作用,可明显减轻实验性肺泡炎症大鼠肺组织炎症损伤,减轻肺间质正常基质结构的破坏;抑制实验性肺纤维化大鼠ECM的沉积,从而抑制肺纤维化的形成。
3在实验性肺纤维化的不同病理阶段,扶正化瘀方有不同的作用机制:1)在肺泡炎症阶段,主要在于抑制MMP-2/9尤其是MMP-2及活化型MMP-2的活性水平,减轻肺组织炎症与组织破坏;抑制ECM生成细胞的活化从而减少了ECM的生成。2)在纤维化期阶段,除了继续抑制MMP-2及活化型MMP-2的活性水平,减轻肺组织炎症;主要是抑制ECM生成细胞的活化,一方面继续抑制ECM的生成,另一方面通过降低TIMP-1/2与α1-AT蛋白表达,提高NE与MMP-9活性,促进弹力蛋白等ECM的降解。
4扶正化瘀方抗肺纤维化的疗效以及对肺组织ECM的作用特点,与其对肝、肾纤维化的有相似之处,证实补虚化瘀是抗器官纤维化的重要中医治法,而改善组织炎症与组织破坏,抑制纤维化组织ECM过度增生与沉积,是扶正化瘀方“异病同治”抗器官纤维化的重要科学基础。