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在我国,胃癌是发生率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一,侵袭和转移是导致死亡的主要因素。因此深入探讨胃癌侵袭和转移机制,寻找胃癌侵袭转移相关的分子,对胃癌的治疗及预后具有重要的意义。microRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA,长度为18~22nt,它能在转录后水平抑制靶基因的表达或翻译,广泛地参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等重要的生物学过程。大量文献表明microRNA可作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生和发展。在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用。研究表明,转化生长因子p1(TGF-β1)在胃癌的表达水平比正常胃黏膜高,且与胃癌的侵袭深度和淋巴结转移、复发呈正相关;患者血清中TGF-β1水平的升高与预后呈负相关。本课题组前期的研究亦发现TGF-β1可以促进胃癌细胞BGC823和SGC7901细胞的侵袭和转移,因此为进一步探讨TGF-β1促胃癌侵袭转移的机制,本课题拟以microRNA芯片分析TGF-β1处理后对胃癌细胞miRNA表达谱的影响并初探差异表达miRNA分子的功能及其作用机制。目前国内外未见相关文献报道。目的:检测TGF-β1刺激后胃癌细胞microRNA差异表达谱的变化,探讨差异表达microRNA分子一miR-193b在胃癌侵袭和转移过程中的作用和机制,为以miR-193b作为靶点的胃癌基因治疗提供理论基础和实验依据。方法:1.使用microRNA芯片检测TGF-β1刺激胃癌细胞后microRNA表达谱的变化。以胃癌细胞BGC823、SGC7901和MKN28为研究对象,使用real-time RT-PCR验证差异表达的microRNA在三株不同分化,对TGF-β1刺激敏感和抵抗的胃癌细胞中的表达水平。2.运用TargetScan, PicTar和miRanda软件对差异表达的microRNA进行生物信息学分析,预测差异表达的microRNA可能的分子作用靶点及其相关的信号通路。3.将带有荧光标记化学合成的miR-193bmimic和inhibitor分子分别瞬时转染胃癌细胞,使用荧光倒置显微镜肉眼观察各组细胞内荧光的数量,real-time RT-PCR检测空白转染组、阴性转染组、转染组各组细胞中miR-193b的表达,以证实转染效果。4.使用Transwell迁移、侵袭实验、划痕实验和裸鼠腹腔肝脏转移瘤形成实验检测miR-193b mimic、miR-193b inhibitor瞬时转染和对胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力的影响。5.以各组转染细胞为研究对象,使用real-time PCR、RT-PCR及Western blotting方法检测miR-193b mimic和inhibitor转染前后miR-193b,uPA mRNA和uPA蛋白表达水平之间的关系,以确定uPA是否为miR-193b在胃癌细胞中的作用靶点。结果:1.TGF-β1刺激胃癌细胞BGC82324h和36h后,在两个不同时间点出现了6个共有的差异表达的microRNA。其中miR-193b,miR-574-3p和miR-130b表达下调,而miR-27a,miR-29b-1和miR-194表达上调。这6个差异表达的microRNA被视为与胃癌的侵袭转移相关。2. miR-193b mimic和inhibitor瞬时转染明显的上调和下调胃癌细胞BGC823中miR-193b的表达水平。miR-193b inhibitor瞬时转染能够增强胃癌细胞BGC823的运动、迁移、侵袭和转移能力。而miR-193b mimic瞬时转染则具有抑制作用。3.uPA可能是miR-193b的直接靶基因,miR-193b在转录后水平抑制uPA蛋白的表达。结论:1.首次运用microRNA芯片和realtime PCR技术对TGF-p信号通路、胃癌的侵袭转移和miRNA三者的相关性进行分析研究,并发现了TGF-β1促胃癌侵袭转移的新机制。2.实验证明6个差异表达的microRNA与胃癌细胞的侵袭转移及TGF-p信号通路相关。3.TGF-β1促进胃癌细胞侵袭转移的作用可能是通过TGF-β1下调miR-193b的表达,miR-193b减少对uPA转录后翻译的抑制,上调uPA的蛋白表达从而促进胃癌细胞的运动、迁移、侵袭和转移。