一牦牛育肥场突然出现牛只食欲废绝、精神沉郁、鼻镜干燥、体温升高,随后大量死亡。剖检后胸腔积液,肺部有类似大理石样病变,瘤胃内充满食物,临床诊断为肺炎。为研究牦牛肺炎及死亡病因,采集死亡牛只的心、肝、脾、肺、肾等样品,进行病原菌分离及相关研究。1.进行了牦牛肺炎病原菌的分离及鉴定、分离菌株的生物学特性研究及耐药谱的确定。对采集的牦牛病料进行病原菌的分离、纯化,革兰氏染色镜检和形态学观察,采用VITEK和16S rRNA PCR扩增测序相结合的方法对病原菌进行鉴定;采用紫外分光光度法测定OD值和活菌计数相结合的方法以及结晶紫染色法对3株菌进行了生长曲线和生物膜形成能力的测定;用K-B药敏纸片法对临床上常用的20种药物进行分离菌株的药敏试验,结合耐药表型用PCR检测分离菌株的相关耐药基因28种。结果显示:分离菌株从生长特性和形态特征上分为3种,均为革兰氏阴性杆菌,经鉴定分离菌株分别是奇异变形杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌,3株菌分别与相关菌株的已知序列同源性均在99%以上,暂时命名为GY1、GY2、GY3。3株菌在0-4 h为迟缓期,5-10 h为对数期,12-18 h为稳定期,20 h以后为衰弱期。3株菌的生物膜形成能力测定中,奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌为中度生物膜形成株,大肠杆菌为微弱生物膜形成株。所有菌株对复方新诺明、苯唑西林、红霉素、万古霉素、克林霉素和四环素6种药物耐药,对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、美罗培南、氟苯尼考和多粘菌素6种药物敏感;耐药基因检测结果为奇异变形杆菌携带的耐药基因ermE、aac,大肠杆菌携带的耐药基因sul2、tetB、vanA、vanB,肺炎克雷伯菌携带的耐药基因vanA、sul1、sul2、aac、shv、fexA。结合耐药表型和携带的耐药基因的结果看出肺炎克雷伯菌的耐药谱最广。2.完成了分离菌株的致病性研究及毒力基因检测。本试验以小鼠为试验对象进行了动物回归试验,采用寇氏改良方法测定了菌株的LD₅₀,后进行动物回归试验,从死亡小鼠脏器中进行细菌分离、鉴定,并对脏器组织进行了病理组织学观察;采用PCR法检测致病菌株所携带的毒力基因。结果表明:、奇异变形杆菌LD₅₀为1.12×10⁸ CFU,大肠杆菌LD₅₀为1.11×10⁸ CFU,肺炎克雷伯菌LD₅₀为1.094×10⁸ CFU;同时,从死亡小鼠的脏器中分离到了相应的病原菌,证明小鼠死亡由感染所致。组织学观察发现小鼠脏器有不同病变,以奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌的混合感染病变最为严重;奇异变形杆菌所携带的毒力基因为hpmA、hpmB、Fli、zapA、rpoA;大肠杆菌携带的毒力基因为ompT、phoA、ompA;肺炎克雷伯菌所携带的毒力基因为kfuBc、arr、wabG、ompT、fimH。结合以上试验确定3株分离菌中以奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌的致病性最强。