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研究目的:自噬(Autophagy)是一种高度保守的溶酶体依赖性的胞内物质降解过程,与癌症、自身免疫性疾病和心血管疾病等密切相关。心血管疾病患者死亡的主要原因是由于动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。据报道,患有全身性自身免疫性疾病患者(如抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)以及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE))其动脉粥样硬化有加速发展的趋势。本组前期研究发现氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox LDL)/β2糖蛋白I(β-2-glycoprotein I,β2GPI)/抗β2GPI抗体(anti-β2GPI)复合物是其致病的主要原因之一,该复合物可导致内皮细胞炎症及黏附因子分泌增多、凋亡加速,平滑肌细胞增殖迁移、凋亡及脂质积累,巨噬细胞摄取脂质增加形成泡沫化细胞等事件,从而促进AS发生发展。此外,鉴于巨噬细胞自噬在AS易损斑块的不稳定性中发挥极其重要的作用,然而ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI对AS中的巨噬细胞自噬有何影响,目前尚未明确。因此本研究在前期研究的基础上,主要探讨ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI对AS中的巨噬细胞自噬的影响,以及主要炎症相关通路TLR4/NF-κB和自噬经典通路PI3K/AKT/m TOR在其中的作用。研究方法:(1)小鼠巨噬细胞株RAW264.7和人单核细胞株THP-1诱导的巨噬细胞经media、ox LDL、ox LDL/anti-β2GPI复合物、oxLDL/β2GPI复合物、β2GPI/anti-β2GPI复合物、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物刺激后,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1蛋白表达水平;自噬双标腺病毒检测各组自噬小体和自噬流通畅程度;透射电镜检测自噬小体;(2)经氯喹(50μM)处理后,Western blot检测各组自噬相关蛋白LC3、P62蛋白表达水平;自噬双标腺病毒检测自噬小体和自噬流通畅程度;(3)分别用TLR4抑制剂(TAK242,5μM)和NF-κB抑制剂(PDTC,20μM)处理后,Western blot检测各组自噬相关蛋白LC3、P62蛋白表达水平;自噬双标腺病毒检测自噬小体和自噬流通畅程度;(4)Western blot检测media、ox LDL、ox LDL/anti-β2GPI复合物、ox LDL/β2GPI复合物、β2GPI/anti-β2GPI复合物、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物各组PI3K、AKT、m TOR蛋白磷酸化水平;(5)经PI3K通路抑制剂(LY294002,50μM)处理后,Western blot检测各组自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1蛋白表达水平以及PI3K、AKT、m TOR蛋白磷酸化水平;自噬双标腺病毒检测自噬小体和自噬流通畅程度。研究结果:(1)经ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI刺激后,巨噬细胞内LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平降低,P62蛋白表达增加,自噬小体减少,自噬流阻断,与media组有显著差异(p<0.05)。(2)经氯喹处理后的ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI组巨噬细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达水平有所增高,自噬小体数量也有增加,但效果不及单独使用氯喹处理组增加明显(p<0.05),而该复合物组的P62蛋白表达水平在氯喹处理前后无明显变化(p>0.05)。(3)经TLR4抑制剂或NF-κB抑制剂预处理后,能够部分恢复ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI抑制的巨噬细胞内自噬相关蛋白的变化(p<0.05),缓解自噬流阻断现象。(4)经ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI刺激后,与media组相比,巨噬细胞内PI3K、AKT、m TOR蛋白的磷酸化水平显著升高(p<0.05)。(5)经PI3K通路抑制剂LY294002预处理后,能够部分恢复ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI抑制的巨噬细胞内自噬相关蛋白表达水平(p<0.05),缓解自噬流阻断现象。结论:(1)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI能够抑制巨噬细胞自噬,阻断自噬流,TLR4或NF-κB抑制剂能部分缓解其自噬的抑制程度,提示TLR4/NF-κB信号通路参与了ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI介导的巨噬细胞自噬过程。(2)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI能上调巨噬细胞内PI3K、AKT、m TOR磷酸化水平,PI3K通路抑制剂能够降低其磷酸化水平,部分恢复巨噬细胞内自噬水平,提示自噬经典通路PI3K/AKT/m TOR也参与了ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI介导的巨噬细胞自噬过程。