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疫霉属病原菌能引起多种毁灭性植物病害,比如致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病和大豆疫霉(Phytophthora sojae)导致的大豆根腐病每年都给农业生产带来严重的危害。疫霉菌基因组通常编码几百个胞内效应因子,以此来干扰寄主的正常生理生化反应,达到定殖、侵染和成灾的目的。RxLR效应因子是一类主要胞内效应因子,其羧基端是高度进化的功能域,氨基端则含有两个保守的结构域(RxLR和dEER)。已有实验证明磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns(3)P]能与RxLR 效应因子结合,促进效应因子转运到宿主细胞内或者提高效应因子在寄主植物中的稳定性。然而对于PtdIns(3)P在植物与疫霉互作过程的功能和机制还有很多问题需要进一步研究,例如它在互作中的来源还尚不清楚。本研究证明疫霉菌可能自身合成该化合物,通过与RxLR效应因子结合来帮助其侵染；提出了一种新型植物抗病策略,即在本氏烟中表达能降低PtdIns(3)P水平的分泌蛋白,干扰病原菌的致病性；还揭示合成PtdIns(3)P关键激酶PI3K复合体相关基因也参与了本氏烟对疫霉的抗性。主要研究内容如下：PtdIns(3)P在疫霉侵染本氏烟过程中的定位与来源分析。在本氏烟中瞬时表达可分泌且能与PtdIns(3)P特异性结合的GFP融合蛋白(FYVE-GFP),当用疫霉菌侵染时,侵染菌丝的表面会聚集该融合蛋白；当用PtdIns(3)P合成关键激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂处理寄生疫霉菌丝时,这种聚集的现象显著减弱；在表达PtdIns(3)P特异性结合的分泌蛋白烟草叶片上接种大豆疫霉PI3K基因的沉默转化子时,菌丝聚集GFP荧光亮度也比野生型有显著的下降。这表明疫霉在侵染本氏烟时表面有大量聚集的PtdIns(3)P且可能是自身合成的。我们用相同的方法验证大豆疫霉RxLR效应因子Avrb也能和侵染菌丝产生的PtdIns(3)P结合。通过对Avrb不同突变体聚集到菌丝现象强弱的检测,证明了C端功能域在其与PtdIns(3)P结合的过程中起了关键性作用,并且RxLR-dEER结够域也具有一定的结合作用。实验结果说明疫霉菌能合成PtdIns(3)P,通过与效应因子结合来促进侵染,是一种新型致病因子。一种新型抗病策略：在植物中表达降低PtdIns(3)P水平的分泌蛋白。根据上述结果,我们推论疫霉自身会合成PtdIns(3)P来促进其侵染,基于此特性,提出一种新型植物抗病策略,即在植物中表达可分泌的PtdIns(3)P特异性结合短肽(FYVE)或分解酶[拟南芥PtdIns(3)P 5-激酶1,AtPIP5K1],来降低病原菌PtdIns(3)P的有效含量,干扰病原菌的致病过程,从而达到植物抗病的目的。实验结果表明,瞬时表达spFYVE或spAtPIP5K1的烟草叶片在寄生疫霉侵染时,病斑面积和侵染菌丝密度显著减小；当用辣椒疫霉侵染时,通过实时荧光定量PCR和显微检测发现菌丝在植物组织中的积累量和侵染点菌丝的密度也显著降低。为了进一步验证这种抗病策略的可行性,通过烟草稳定转化获得了转基因烟草,并对其抗病性进行了测定。接种结果表明,spFYVE和spAtPIP5K1转基因烟草叶片在辣椒疫霉和寄生疫霉侵染时,病斑直径和侵染点菌丝密度与对照相比显著减小,并且侵染点过氧化氢的积累和胼胝质的沉积明显增多。而作为对照的非分泌FYVE和AtPIP5K1的接种表型与GFP转基因叶片没有显著性差异。结果说明,创制转基因作物表达分泌型PtdIns(3)P结合蛋白或分解酶,可以降低PtdIns(3)P的有效含量,干扰病原菌的致病过程,从而达到控制病害目的,这是一种新型病害控制策略。本氏烟PI3K复合体相关基因在其抗病过程中的功能分析.为了进一步研究PtdIns(3)P在互作中的功能,本实验选择PI3K复合体关键组分NbVPS15、NbVPS30和NbVPS34进行了功能研究。结果表明,NbVPS15和NbVPS34基因在辣椒疫霉和大豆疫霉侵染过程中有不同程度的上调表达现象,暗示其可能参与了本氏烟对疫霉菌的抗病反应；利用病毒介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默了本氏烟本NbVPS15或NbVPS34基因后,植物体对疫霉菌(辣椒疫霉和寄生疫霉)更抗病,侵染点的菌丝密度显著降低而过氧化氢的积累和胼胝质的沉积明显增多；但对于死体营养型真菌灰霉菌,本氏烟NbVPS15和NbVPS34基因沉默植株抗性没有变化。研究还发现,在沉默NbVPS34的烟草叶片中表达大豆疫霉效应因子(Avr1b或者Avh18),其蛋白稳定性降低；而分别在这三个基因的沉默叶片上注射能引起细胞死亡的疫霉菌激发子、效应因子和抗病基因无毒基因组合时,对它们引起的细胞死亡被限制在注射区域有不同程度的影响。本研究证明本氏烟NbVPS15和NbVPS34参与了其对疫霉菌的抗性,其机制可能与调控植物体内PtdIns(3)P平衡以及自噬介导的细胞死亡有关。