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禽大肠杆菌病由于其发病率高,病原菌血清型多样对各国禽类养殖业产生严重危害。APEC中的PhoP-PhoQ二元调控系统主要参与调控细菌毒力基因的表达、细菌对Mg2+限制性生长环境的适应过程、上皮细胞侵袭和抗菌肽抗感染等过程,在禽致病性大肠杆菌致病的过程中发挥着重要的调控作用。有研究发现酸性pH、低Mg2+和抗菌肽能够促进PhoP的磷酸化,激活PhoP蛋白调控的下游靶基因使细菌适应环境的改变。因此本研究以AE17、△phoP、△phoQ和△phoPQ缺失株为研究对象,以Mg2+浓度,酸性pH和禽β防御素(AvBD9)为培养条件检测其细菌的体外生长情况。通过制备PhoP兔源多克隆抗体,利用RT-qPCR和Western blot方法检测不同pH、Mg2+浓度和AvBD9培养环境中phoP基因转录和表达的变化,为进一步研究PhoP在APEC中的调控作用提供理论依据。主要研究内容如下:1.PhoP蛋白表达条件的优化及PhoP多克隆抗体的制备与检测本试验通过优化诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时间和细菌浓度等条件,筛选出目的蛋白表达量最高的优化条件。结果显示菌液培养至OD600nm为1.0时加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,并在25℃的摇床中诱导1 1h PhoP蛋白表达量最高,运用BAC蛋白含量测定法检测其浓度为3.621 mg/ml。用纯化的PhoP蛋白作为免疫抗原对兔进行四次免疫,利用双向琼脂扩散法和ELISA法测定免疫血清的效价;Western blot法检测免疫血清的特异性。双向琼脂扩散结果表明兔抗PhoP多克隆抗体的效价为1:16;ELISA实验结果表明兔抗PhoP多克隆抗体效价为1:209715200;Western blot的结果表明PhoP重组蛋白能与兔血清中的抗体特异性结合。2.酸性pH对AE17菌株phop基因表达量的影响为了研究酸性pH是否影响禽致病性大肠杆菌的体外生长和phop基因表达量的变化,本试验通过用不同pH的LB肉汤培养基培养细菌,比较在正常和酸性pH条件下AE17和△phoP、△phoQ和△phoPQ缺失株的体外生长速率,并利用RT-qPCR和Western blot的方法分别检测phoP mRNA转录表达变化和蛋白表达量的变化。体外生长速率测定结果显示,酸性pH影响AE17菌株的体外生长,并且在pH5.0和pH4.5培养条件下△phoPQ缺失株的生长速率高于AE17野生株;△phoP和△phoQ缺失株生长速率低于AE17野生株。RT-qPCR和Western blot的结果显示AE17菌株phoP基因的转录水平和蛋白表达水平在不同pH培养条件下的不同时间点呈现不同程度的上调和下调。3.Mg2+浓度和酸性pH对AE17菌株phop表达量的影响为了探讨Mg2+浓度是否影响禽致病性大肠杆菌的体外生长和phop基因表达量的变化,本试验通过不同Mg2+浓度培养APEC测定Mg2+浓度是否影响APEC的体外生长速率。结果显示,在Mg2+浓度低于250μM时AE17菌株的生长显著降低。然后选择250 μM的Mg2+浓度,研究在不同pH下是否影响AE17菌株的生长。结果显示,AE17菌株在pH5.0、5.5和7.0时正常生长,pH4.5时缓慢生长,在pH4.0时不生长。RT-qPCR和Western blot的结果显示AE17菌株phoP基因的转录水平和蛋白表达水平在Mg2+浓度为250μM的不同pH培养条件下呈现不同程度的上调和下调。4.AvBD9对AE17菌株phop表达量的影响为了研究禽β防御素是否对APEC基因phop转录和表达水平的影响,本研究基于AvBD9和AE17共培养,然后再通过RT-qPCR和Western blot的方法检测phoP的mRNA转录水平和蛋白表达水平变化。结果显示随着时间的增加,phoP的mRNA转录水平随之减少。与没有加入AvBD9处理的相比,加入AvBD9后phoP的mRNA转录水平在培养30 min后表达量减少,在培养120 min后表达量趋于平缓且差异显著。这一结果表明了禽p防御素调控phoP的转录和表达。通过在pH、Mg2+和AvBD9不同的培养条件培养AE17结果表明了 pH和Mg2+浓度和禽β防御素均影响AE17的体外生长,且这些信号刺激调控phoP基因的转录和表达。研究APEC在不同酸性pH、Mg2+浓度和禽β防御素的条件下对phoP基因转录和表达水平有影响,为进一步研究转录调控子PhoP在禽致病性大肠杆菌中的调控作用提供理论依据。