精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物体内特有的能够将亲本遗传信息传递给子代的一类成体干细胞,具有自我更新与分化能力,可替代胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)用于治疗和遗传修饰,且不涉及伦理道德和免疫排斥问题。为此,国内外科学家致力于在体外诱导形成大量具有功能的SSCs的研究,在临床医学可用于治疗不孕不育。然而,随着对SSCs发生机制的深入研究,发现其存在体外诱导效率低,获取细胞数量少且质量不佳,体外诱导和培养体系不稳定等问题。这导致SSCs的应用受到了极大的限制。因此,系统全面研究影响SSCs发生的调控机制显得尤为重要。本课题组前期采用ChIP-Seq技术对鸡雄性生殖细胞分化过程中ESCs、PGCs和SSCs三种细胞的组蛋白H3K4甲基化水平进行检测,经分析确定组蛋白H3K4me2在鸡SSCs形成过程中存在差异表达,提示H3K4me2对鸡SSCs的形成发挥重要调控作用,但具体作用机理尚未阐明。为了深入研究H3K4me2对鸡SSCs发生的具体调控作用,本研究结合实验室前期建立的鸡ESCs无饲养层RA培养诱导体系和鸡胚血管注射操作体系,利用RNAi干扰技术干扰组蛋白甲基化酶MLL2和去甲基化酶LSD1的表达,改变体内和体外鸡SSCs形成过程中组蛋白H3K4me2水平,从而探究组蛋白H3K4me2在鸡SSCs形成过程中的调控作用,并在此基础上分别通过RNA-seq和CHIP-qPCR寻找与组蛋白H3K4me2甲基化相作用的下游靶基因,研究二者对鸡SSCs形成的调控关系和靶向关系。本研究为弄清SSCs发生的表观遗传学机制奠定理论依据,同时在生产实践中为提高家禽生产力提供参考资料。本研究的结果如下:(1)组蛋白甲基化修饰酶和H3K4me2在鸡不同组织、细胞中时序表达与定位研究筛选确定调控鸡雄性生殖细胞发生过程中H3K4me2的特异性甲基化转移酶(ASH2L,MLL2,MLL5)和去甲基化酶(LSD1,KDM5A,KDM5B),RT-qPCR检测各组蛋白修饰酶在鸡不同细胞和组织中的表达分布,结果发现ASH2L(23.03±0.02),MLL2(467±0.016),MLL5(9.46±0.046)和LSD1(846.81±0.024)在鸡睾丸组织中的表达量最高;而KDM5A(140.06±0.024)和KDM5B(13.47±0.516)在卵巢组织中的表达量最高,在睾丸组织中表达较低。同时这些组蛋白修饰酶ASH2L(2.79±0.080),MLL2(1.05士0.004),LSD1(4.03±0.082),KDM5A(3.88±0.008),KDM5B(2.51±±0.081)在鸡 PGCs 中表达最高,而MLL5(5.24±0.080)在鸡SSCs中表达最高;Western blot检测发现组蛋白H3K4me2甲基化水平在鸡ESCs和PGCs中显著高于SSCs,而在成体组织心脏、肝、脾、肺、肾脏、睾丸和卵巢中没有明显的表达差异;细胞化学免疫荧光结果进一步发现H3K4me2在鸡SSCs中呈现核周表达。以上结果初步表明组蛋白修饰酶和H3K4me2在鸡雄性生殖细胞发生过程中存在重要调控作用。(2)调控鸡SSCs形成过程中组蛋白H3K4me2甲基化修饰酶的筛选根据NCBI数据库提供ASH2L,MLL2,MLL5,LSD1,KDM5A和KDM5B的CDS序列,分别设计3个shRNA靶位点,测序结果表明成功构建各慢病毒干扰载体;将构建成功的慢病素干扰载体转染生长良好的鸡DF1细胞提取RNA,通过RT-qPCR筛选出各个载体最佳干扰序列,分别为ASH2L-shRNA2、MLL2-shRNA3、MLL5-shRNA3、LSD1-shRNA1、KDM5A-shRNA1和 KDM5B-shRNAl,干扰效率分别达到 88%、65%、79%、68%、60%和 67%;Western blot结果进一步表明只有MLL2-shRNA3能显著地降低组蛋白H3K4me2甲基化水平,而LSD1-shRNA1能显著增加组蛋白H3K4me2甲基化水平。因此,将组蛋白H3K4甲基化酶MLL2和去甲基化酶LSD1筛选确定为调控鸡SSCs形成过程中组蛋白H3K4me2水平的关键候选酶。(3)组蛋白H3K4me2甲基化调控鸡SSCs形成的作用研究通过体内和体外实验共同研究H3K4me2在鸡SSCs形成过程中的功能。结果发现:在体外,RT-qPCR结果表明在鸡 ESCs 中 shRNA-MLL2 能显著下调 MLL2 的表达(0.34±0.01 vs 1.00±0.02),shRNA-LSD1能显著下调LSD1的表达水平(0.42±0.03 vs 1.00±0.02);Western blot结果表明在鸡ESCs中shRNA-MLL2组的H3K4me2甲基化水平降低,shRNA-LSD1干扰组的H3K4me2甲基化水平增加;通过对诱导至第12d的各组细胞形态进行观察,结果发现RA诱导组和shRNA-LSLD1组在诱导至12d可形成聚团成葡萄串状的类精原干样细胞(Spermatogonial stem cells-like,SSCs-like),而 RA+shRNA-MLL2 组则无法诱导出 SSCs-like;RT-qPCR 结果表明与 RA 诱导组相比,shRNA-LSD1 组中 Cvh、Blimp-1、Stra8、LIN28、integrina6和integrin β1等生殖标记基因的表达呈上调趋势,而在RA+shRNA-MLL2组中却一直处以低水平表达;细胞化学免疫检测结果表明在诱导至4d,相对于RA诱导组(16.14%士0.42),RA+shRNA-LSD1组中Cvh+和 C-kit+双阳性的细胞显著增加(26.03%±0.47),而在RA+shRNA-MLL2 组中,Cvh+和 C-kit+双阳性的细胞却显著下降(8.98%±0.25)(p<0.01)。同样在诱导至第12d,与RA诱导组相比(6.15%±0.43),RA+shRNA-LSD1组中integrina a6t和integrin β1+双阳性的细胞显著增加(9.31%±0.47),而在RA+shRNA-MLL2组中integrin a6+和integrinβl+双阳性的细胞却显著下降(5.32%±0.25)(p<0.01);流式细胞分析结果表明诱导至4d后,LSD1干扰组中Cvh(8.6±0.3%)和C-kit(7.2±0.1%)阳性细胞比例均显著高于RA组,而MLL2干扰组中Cvh(2.2±0.1%)和C-kit(1.5±0.1%)阳性细胞比例均显著低于RA组(p<0.01)。同样,诱导至 12d 后 LSD1干扰组中 integrin a6(14.9±0.2%)和 integrin β1(15.5士0.2%)阳性细胞比例均显著高于RA组,而MLL2干扰组中integrin a6(10.5±0.2%)和integrinβ1(5.6±0.2%)阳性细胞比例均显著低于RA组织(p<0.001)。在体内,通过体式荧光显微镜观察发现慢病毒干扰载体能在5.5d鸡胚中表达绿色荧光蛋白,而空白组不显示任何绿色荧光;RT-qPCR结果表明在鸡胚体内慢病毒干扰载体shRNA-MLL2和shRNA-LSD1可显著干扰MLL2和LSD1的mRNA水平,干扰效率可分别达到68%和76%(p<0.01);Western blot结果表明干扰MLL2后H3K4me2甲基化水平降低,而干扰LSD1后H3K4me2甲基化水.平增加;RT-qPCR结果表明:在孵化至18d的睾丸组织中,与对照组相比,shRNA-MLL2注射组中Dazl、Stra8、integrin a65、integrin β1等生殖标记基因显著下调至0.37±0.05,0.43±0.02,0.19±0.03 和 0.78±0.06(p<0.01),而 shRNA-LSD1 注射组中St a8、integrin a6、integrin β1等生殖相关基因同样显著上调到1.14±0.03,1.51±0.01和1.69±0.06(p<0.01);流式细胞检测结果表明:孵化至18d的鸡胚中,Blank组(26.3%±0.1;26%±0.2)和shRNA-NC组(9.4%±0.1;9.7%±0.1)之间没有显著性的差异,而shRNA-MLL2组中SSCs数量(14.1%±0.2;5.1%±0.2)显著低于 Blank组和 shRNA-NC组(p<0.01),shRNA-LSD1 组中 SSCs数量(31.30%±0.4;12.4%±0.3)显著高于Blank组和shRNA-NC组(p<0.01);Western blot结果表明:与对照组相比,LSD1干扰组的integrin a6和integrin β1的蛋白表达量高于对照组,而MLL2干扰组中这两种蛋白表达量低于对照组。以上体内和体外实验结果均表明干扰MLL2,组蛋白H3K4me2水平降低,相关生殖标记基因和蛋白表达被抑制,从而导致鸡SSCs形成受阻;而干扰LSD1后H3K4me2水平升高,激活生殖标记基因和蛋白的表达,最终促进鸡SSCs的形成。(4)组蛋白H3K4me2甲基化调控鸡SSCs形成的表观机制研究采用IlluminaSolexa转录组测序技术对不同处理组鸡SSCs进行转录组测序,结果发现在shRNA-MLL2和Blank组中共有差异基因17431个,其中相对于Blank组有8473个基因表达上调,有8958个基因表达下调;shRNA-LSD1和Blank组中共有差异基因17334个,其中相对于Blank组有9086个基因上调,有8248个基因下调。GO分析结果表明组蛋白甲基化酶MLL2和去甲基化酶LSD1具有催化活性并与SSCs中蛋白及DNA的结合有关,还与细胞分化,生殖过程及精子发生等生物过程密切相关;KEGG Pathway结果进一步表明MLL2和LSD1能够影响与精原干细胞形成密切相关的TGF-β,Wnt以及MAPK等通路中多个基因的表达;CHIP-qPCR结果表明MLL2和LSD1能够与下游DDX4、BMP4、DAZZL、Blimp-1、LIN28a等生殖标记基因的启动子结合,并影响结合区域中H3K4me2水平从而调节基因的表达。敲低MLL2 后,DDX4、BMP4、DAZL、Blimp-1、LIN28a启动子区 H3K4me2 水平降低导致基因表达被抑制,继而抑制鸡SSCs的形成。而敲低LSD1后,上述基因启动子区H3K4me2水平升高,基因的表达被激活,进而促进SSCs的形成。