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目的DNA 甲基转移酶 1(DNA(cytosine-5)methyltransferase 1,DNMT1)是肺癌等恶性肿瘤的重要生物标志之一。检测其在生物样本中的表达活性和水平对癌症的早期诊断和预后有很重要的意义。本研究拟采用磁性纳米颗粒作为固相载体,采用自组装核酸探针信号放大技术建立检测DNMT1表达活性和水平的新方法,为临床样本中DNMT1活性和水平的检测提供新选择,为肿瘤的早期诊断提供新思路。方法1.自组装核酸探针信号放大技术检测DNMT1活性方法的建立首先,利用链霉亲和素和生物素的高亲和力将生物素化的DNMT1作用序列(Biotin-S1’-S2’)固定到链霉亲和素磁珠上。其次,利用自组装的方法构建荧光信号放大探针聚四甲基罗丹明(聚TAMRA)。之后,将构建好的聚TAMRA通过DNA杂交作用连接到Biotin-S1’-S2’上,利用聚TAMRA上含有多个荧光染料TAMRA实现荧光检测信号的放大。最后加入目标物DNMT1和限制性内切酶BssHⅡ。当DNMT1存在时,可将半甲基化的Biotin-S1’-S2’完全甲基化,使其不被BssHⅡ识别和切断,荧光信号较强;当DNMT1不存在时,BssHⅡ可识别并切断半甲基化Biotin-S1’-S2’,聚TAMRA荧光探针被洗去,荧光信号变弱。对链霉亲和素磁珠、Biotin-S1’-S2’、S3-TAMRA、聚TAMRA的用量以及链霉亲和素磁珠和生物素结合的时间进行单因素法优化,建立检测浓度依赖性DNMT1活性的方法,并对所建立的检测方法进行方法学评价。2.自组装核酸探针信号放大技术检测DNMT1水平方法的建立利用碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)活化法将DNMT1单克隆抗体(McAbDNMT1)固定在羧基磁珠上,构成免疫磁珠。免疫磁珠可以特异性捕获待测物DNMT1,清洗后加入DNMT1多克隆抗体(PcAbDNMT1)和生物素化羊抗兔IgG(羊抗兔IgG-Bio),构成双抗夹心免疫磁珠;在桥联介质链霉亲和素存在的情况下将生物素化聚荧光素(Biotin-聚FAM)连接到双抗夹心免疫磁珠上,形成双抗夹心免疫磁珠和Biotin-聚FAM的复合物。免疫磁珠可以捕获样品中的目标物DNMT1,Biotin-聚FAM可以实现信号放大。对羊抗兔IgG-Bio稀释比、链霉亲和素、Biotin-聚FAM的用量进行了单因素法优化,建立检测DNMT1表达水平的方法,并对该方法进行方法学评价。结果1.自组装核酸探针信号放大技术检测DNMT1活性方法的建立(1)聚TAMRA的表征:琼脂糖凝胶电泳结果显示聚TAMRA由长短不一的双链DNA组成,其放大效果是单独的S3-TAMRA的2倍。(2)DNMT1 作用序列的选择及固定:在 Biotin-S1-S2、Biotin-S1-1-S2、Biotin-S1-2-S2、Biotin-S1’-S2’四种 DNMT1 作用序列中,Biotin-S1’-S2’作为DNMT1的作用底物时,DNMT1-可以很好的发挥其催化功能,因此选择-Biotin-S1’-S2’作为DNMT1的作用序列。实验测得Biotin-S1’-S2’与链霉亲和素磁珠的平均结合效率为79.37%,表明其能成功固定在链霉亲和素磁珠上。(3).条件优化:对建立的方法进行单因素优化,最优条件为25 μL链霉亲和素磁珠为最佳用量,Biotin-S1’-S2’的最佳浓度为300 nmol/L,S3-TAMRA的最佳浓度为600nmol/L,聚TAMRA的最优浓度为300 nmol/L,链霉亲和素磁珠和生物素的结合时间为20 min。(4)标准曲线和方法学评价:在1mmol/L～100 nmol/L线性范围内,对应的标准曲线为 Y=168.59X+74211.43(X 为 CDNMT1,Y 为荧光强度 F),r=0.9863。检出限为0.5nmol/L,相对标准偏差(RSD)范围为0.64%-11.20%,低、中、高三个浓度标准溶液的加标回收率分别为78.9%、115.2%、102.9%。2.自组装核酸探针信号放大技术检测.DNMT1水平方法的建立(1)Biotin-聚FAM的表征:琼脂糖凝胶电泳显示Biotin-聚FAM由长短不一的DNA双链构成,最长的链可达到500 bp,可起到信号放大作用。(2)免疫磁珠的表征:免疫磁珠的扫描电镜显示,相较于羧基磁珠而言免疫磁珠表面更为粗糙,可以初步判断McAbDNMT1成功修饰到羧基磁珠表面,免疫磁珠构建成功。对免疫磁珠的免疫活性进行ELISA实验,结果表明其保留了抗体的免疫活性。(3)条件优化:采用单因素方法对实验条件进行优化,得到链霉亲和素的最佳浓度为8 μmol/L,羊抗兔IgG-Bio的最佳稀释比为1:600,Biotin-聚FAM的最优浓度为700 nmol/L。(4)标准曲线和方法学评价:在2 nmol/L～200 nmol/L线性范围内,标准曲线为 Y=0.28814X+0.01782(X 为 lgCDNMT1,Y为1g(F/F0)),r=0.9962,检出限为0.05 nmol/L,相对标准偏差(RSD)范围为4.89%～16.27%,低、中、高三个浓度标准溶液的加标回收率分别为140.0%、94.0%、101.3%。结论该研究利用磁性纳米颗粒作为固相载体,结合核酸自组装信号放大技术分别建立了检测DNMT1表达活性和水平的新方法,显示出检出限低、特异性强的优势。该方法有望应用于实际血清样品中DNMT1活性和水平的检测中,为临床研究提供参考。