普鲁兰(pullulan)是一种由出芽短梗霉合成的微生物胞外多糖。作为一种化学结构独特的水溶性高分子聚合物,普鲁兰具有良好的可塑性、成膜性和稳定性,因而可以安全地应用于食品、医药、环保和轻工等诸多领域。利用出芽短梗霉细胞好氧发酵合成普鲁兰是目前该多糖生产的主要方法。虽然已有大量提高普鲁兰发酵产量和分子量的研究报道,但是针对出芽短梗霉生物合成普鲁兰过程中蕴含的生理生化机制研究才刚刚开始。本论文以一株不产色素的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012259)为实验菌株,以实现普鲁兰的高产量和/或高分子量以及降低原料成本为目标,采用一系列发酵过程优化策略对普鲁兰分批发酵过程进行优化。从影响普鲁兰分批发酵的营养和环境因素入手,探讨了有利于普鲁兰高效合成的内在生理生化机制,并对发酵过程的经济性进行分析,主要研究结果如下:1.分别考察了发酵培养基中不同浓度硫酸按和酵母粉对普鲁兰产量的影响,发现氮源限制可以提高普鲁兰的产量。当硫酸铵和酵母粉的浓度分别为0.3 g/L和1.5 g/L时,普鲁兰产量在66 h时达到最大值25.3 g/L,比不限氮时提高了14.0%。相关生理生化指标显示,限氮条件提高了PGM和FKS酶活,上调了pgm1和fks基因的转录水平,增加了胞内ATP含量和ATP/ADP比率,为普鲁兰的过量合成提供了充足的物质和能量基础。在普鲁兰分批发酵过程中应用限氮补碳策略,在36 h补加葡萄糖至总糖浓度为70 g/L,最终在72 h时普鲁兰产量为39.8 g/L,比不限氮补糖下的结果高出16.0%。发酵过程经济性分析结果表明,限氮补碳使普鲁兰合成的原料成本明显下降。2.在5 L发酵罐中考察了不同恒定搅拌转速对普鲁兰分批发酵的影响,结果发现最适合出芽短梗霉细胞生长和获得最大Mw的转速是500 rpm,而最有利于普鲁兰合成和最终Mw的转速是400 rpm。通过分析普鲁兰分批发酵动力学参数,测定FKS和普鲁兰降解酶等关键酶的活性,结合胞内能量代谢物质水平和比率的变化规律,以高分子量普鲁兰的高产为目标,提出了两阶段搅拌转速控制策略,即在分批发酵的开始阶段将转速控制在500rpm,18 h时将转速切换至400 rpm并维持至发酵结束。在此两阶段搅拌转速控制策略下,普鲁兰的最终分子量为3.09×106 Da;普鲁兰产量为27.4 g/L,比恒定转速400 rpm和500 rpm下产量分别提高了13.7%和17.6%。3.考察NaCl对出芽短梗霉生物合成普鲁兰的影响,与培养基中不添加NaCl的对照相比,NaCl提高了普鲁兰的产量,但降低了普鲁兰的分子量。当NaCl浓度为3g/L时,普鲁兰的产量为28.9 g/L,比对照提高了26.7%,但分子量在72 h时只是对照的47.0%。分别测定了普鲁兰合成和降解过程中关键酶的酶活,结果表明NaCl的存在提高了分批发酵前期FKS的活力,也提高了发酵后期普鲁兰降解酶的活力。对出芽短梗霉细胞内的转录组样本进行测序和分析,结果显示当发酵培养基中NaCl浓度为3 g/L时,有77个基因在实验组中高表达,其中包括pgml和fks,只有2个基因在实验组中低表达。通过对这些差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路注释分析,发现NaCl的添加提高了普鲁兰合成、分泌和水解相关酶以及能量合成酶相关基因的表达,部分解释了NaCl促进普鲁兰合成但也降低了普鲁兰分子量的内在原因。4.在摇瓶水平上证实了稻壳水解液可以用作碳源培养出芽短梗霉细胞并合成普鲁兰,但是普鲁兰产量明显低于葡萄糖或木糖作为单一碳源发酵结果。通过对不同预处理方式下的稻壳水解液中的抑制物成分进行分析,发现并经摇瓶发酵实验证实了乙酸是抑制普鲁兰合成的主要因素。为了降低普鲁兰合成酶乙酸的敏感性,在含有未经任何处理的稻壳水解液的培养基平板上,逐渐提高稻壳水解液的含量,采用适应性进化技术对出发菌株进行驯化,选育获得了一株能够适应乙酸环境的突变株A.pululans ARH-1。与出发菌株相比,该突变株具有更高的利用稻壳水解液合成普鲁兰的生产效率,酶活分析结果证明了突变株细胞解除了乙酸对普鲁兰合成酶活性的抑制。5.在考察了玉米浆粉和豆粕水解液替代酵母粉用于普鲁兰生物合成可行性的基础上,采用响应面分析法分别对发酵培养基中硫酸铵与玉米浆粉及豆粕水解液的含量和比例进行优化。以普鲁兰高产为目标,得到最佳的混合氮源组合分别为1.28 g/L硫酸铵和4.68 g/L玉米浆粉,以及1.25 g/L硫酸铵和12.41 mL/L豆粕水解液。5L发酵罐中的普鲁兰分批发酵结果显示出芽短梗霉利用玉米浆粉合成的普鲁兰分子量与酵母粉大体相当,但产量降低14.4%;利用豆粕水解液合成普鲁兰的产量与酵母粉基本持平,但分子量远低于利用酵母粉的水平。对发酵培养基中的氮源物质进行经济性分析,结果发现利用玉米浆粉和豆粕水解液生产普鲁兰的氮源成本分别只相当于酵母粉的18.5%和56.1%,原料成本可以大大降低。对利用两种替代有机氮源合成的微生物多糖进行结构表征,FTIR图谱中的特征峰表明该多糖即为普鲁兰。