目的 研究中国汉族人IRS-2基因G1057D突变与T2DM是否相关,肥胖尤其是中心性肥胖在其中的作用,以及存在IRS-2基因G1057D突变的健康人有无发展为T2DM的潜在遗传倾向,从而为T2DM的早期发现,正确分型、有效治疗、合理预防及新药的开发研制奠定理论基础。 方法 以辽宁地区汉族人群为研究对象,根据研究目的进行三项研究。 第一项研究: 1 对象:为OGTT正常、无DM家族史的40—60岁的健康者221人。测腰、臀围及身高、体重,计算WHR及BMI。以BMI≥25kg/m~2为界点,分为肥胖(临床上排除与遗传、内分泌及中枢神经系统疾病有关的肥胖和肥胖综合征)及非肥胖两组。其中肥胖组113人,非肥胖组108人,两组年龄、性别相匹配。 2 方法:运用PCR-RFLP分析方法,对实验对象IRS-2基因G1057D突变进行筛查,同时探讨与T2DM发病机制相关的INS分泌和INS作用的简易指标:FPG、FINS、FCP、2hPG、2hINS、2hCP、HOMAB、HOMAIR等8个参数及BMI、WHR、血脂、血压等指标的相关性。 (1)突变基因筛查:①基因组DNA制备:取空腹静脉血2ml,EDTA抗凝,分离白细胞,采用常规饱和氯化钠法抽提基因组DNA;②PCR扩增:PCR引物由在线软件Primer3完成,上海生工生物工程公司合成。上游引物为5′-gtccccgtcgtcgtctct-3′,下游引物为5′-ctcgactcccgacacctg-3′。反应体系含模板DNA、缓冲液、四种dNTP、引物及Tag酶。反应步骤为预变性94℃5min后,进入主循环。通过94℃变性50s、58℃退火50s、72℃延伸50s共30个循环及终末72℃再延伸7min的过程,在PCR扩增仪(USA Perkin-Elmer9600型)上完成PCR扩增;③RFLP检测:扩增物经1.2%琼脂糖凝胶电泳确认扩增结果后,继以限制性内切酶HaeⅡ(NEB)37℃过夜酶解PCR产