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第一部分大鼠骨髓间质干细胞的分离培养和鉴定实验一大鼠骨髓间质干细胞的分离和培养目的：分离和培养大鼠的骨髓间质干细胞。掌握原代细胞的培养技术，了解干细胞的生物学特性。材料和方法：四月龄的SD大鼠，沿用Friedenstein的方法，利用间质干细胞粘附于组织培养板的特性，首先利用梯度离心分离出单核细胞，再利用干细胞粘附于塑料培养板的特点，获得较纯的贴壁生长的骨髓间质干细胞。结果：细胞贴壁较快，呈克隆生长，细胞形态为均一的长梭形。在接种24小时后可见成纤维状的细胞以散在的方式贴壁，2-3天就可见一些集落形成，7-10天后集落迅速增多，并且逐渐长大融合成片。随着集落生长的不断扩大而融合为单层。传代培养后细胞不再以成集落的方式生长，而是呈均匀分布生长。原代培养结束时细胞数为105左右，P10代细胞数约为1012左右。结论：大鼠骨髓间质干细胞的分离和培养技术成熟，细胞增殖能力旺盛。实验二大鼠骨髓间质干细胞的鉴定目的：通过表面抗原检测确定培养细胞的正确性。为下一步实验确定良好的种子细胞。材料和方法：通过流式细胞仪检测大鼠骨髓间质干细胞的表面抗原，包括CD29，CD44，CD90，CD105，CD34，CD45，CD11b，组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ。结果：与对照组相比，大鼠骨髓间质干细胞表面抗原CD29，CD44，CD90，CD105显示阳性，而表面抗原CD34，CD45，CD11b为阴性，组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ均为阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞表面标志为非单一性，表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，一般认为整合素家族成员CD29，粘附分子CD44、CD105以及胸腺和外周T淋巴细胞标志CD90等是骨髓间质干细胞的重要标志物。第二部分腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较目的：携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒和腺病毒载体系统感染大鼠骨髓间质干细胞，观察感染后GFP的表达情况及持续时间，比较两种载体的优缺点。材料和方法：重组质粒pHIV-CS-CDF-CG-PRE（含有GFP基因）及包装质粒pRSV-Rev，pMDLg／pPRE，pMD.G在293细胞感染和收集病毒颗粒；腺病毒载体（含有GFP基因）自购，分别感染大鼠骨髓间质干细胞，观察GFP蛋白表达情况；流式细胞仪检测GFP表达情况。结果：感染一周，慢病毒和腺病毒系统对大鼠骨髓间质干细胞的感染效率均较高，荧光蛋白表达良好，慢病毒GFP表达90％，腺病毒达到71％，；三周后，慢病毒系统干细胞的感染表达良好，约83.2％，但腺病毒系统的感染表达已明显下降，仅达到0.13％，；五周后，慢病毒系统的感染表达仍保持良好，约79％，而腺病毒仅剩0.05％。。结论：慢病毒载体系统对大鼠骨髓间质干细胞感染后GFP表达和持续时间明显高于腺病毒载体系统，第三部分人骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体构建目的：将人骨形态发生蛋白2基因克隆到新型慢病毒载体中，用于下一步的基因治疗方面的研究。材料和方法：从肝脏组织中抽提总RNA后；设计NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物，扩增出BMP-2的全长序列，克隆到慢病毒重组质粒pHIV-CS-CDF-CG-PRE，通过PCR、酶切、测序等方法筛选鉴定重组质粒。结果：成功扩增出1.2kb左右的BMP-2全长序列，序列比对分析与Genebank中humanBMP-2阅读框架序列100％吻合。第四部分携带hBMP2基因的慢病毒载体的包装和体外表达目的：包装慢病毒载体、测定其病毒滴度、检测其蛋白表达情况。材料和方法：重组质粒pHIV-CS-CDF-CG-PRE（含有hBMP2基因），包装质粒pRSV-Rev，pMDLg／pPRE，pMD.G在293T细胞感染和收集病毒颗粒。用ELISA的方法检测慢病毒的滴度。间接免疫荧光分析和WESTERN BLOTTING分析检测hBMP2基因的体外表达情况。结果：慢病毒载体系统包装顺利，经测定其滴度为2.92×109，间接免疫荧光分析和WESTERN BLOTTING分析hBMP2基因的表达情况良好。第五部分携带hBMP2基因的慢病毒感染骨髓间质干细胞的定向分化目的：观察慢病毒载体诱导rMSCs后的变化情况，检测rMSCs是否按预期方向向成骨细胞转化。材料和方法：含有hBMP2基因的慢病毒载体诱导rMSCs，诱导第0、3、6、9、12、15、18、21天测定碱性磷酸酶的活性及细胞染色情况；采用钙的定量测定沉积钙的浓度；免疫组化分析Ⅰ型胶原蛋白表达情况。结果：诱导后的rMSCs，随着大鼠骨髓间质干细胞诱导时间的延长，其碱性磷酸酶的活性逐渐增加，染色良好，而未经病毒诱导的干细胞，培养21天，其碱性磷酸酶的活性无明显的变化；诱导组Ca2+的浓度持续升高，到第15天后Ca2+的浓度达到最大，此后达到平稳期，未诱导组钙沉积无明显变化；诱导组Ⅰ型胶原蛋白表达明显增加，染色呈阳性，而未诱导组无明显变化。结论：通过免疫组化和组织化学技术证明，诱导的rMSCs细胞能够产生Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶，并具有矿化能力，证实在慢病毒载体的诱导下rMSCs向成骨细胞分化。