前言　　P物质(SubstanceP，SP)是发现最早的神经肽之一。通过重组DNA技术研究SP，发现SP来源于前速激肽原(Pre-Protachykinin，PPT)，因此SP属于速激肽(Tachykinin，TK)成员。研究发现SP是神经内分泌免疫网络中的重要一员，是神经内分泌和免疫系统共同的化学语言。　　NK细胞属于大颗粒淋巴细胞，是天然免疫系统的重要组分。成熟NK细胞主要聚集于脾脏、肝脏和外周血。研究表明，NK细胞可通过细胞介导的细胞毒作用杀伤非己细胞，并通过释放多种细胞因子和趋化因子来调节天然免疫和获得性免疫。根据表面标志和功能的不同，可以将NK细胞分为不同的亚群。小鼠NK细胞库是由不同表型、功能的NK细胞亚群组成。CD27与CD11b联合可以作为小鼠NK细胞亚群划分的依据，因成熟小鼠NK细胞高表达CD11b，因此可将成熟小鼠NK细胞划分为CD11bhiCD27hi、CD11bhiCD27lo两个亚群。这两个细胞亚群在免疫应答的过程中发挥着不同的生物学功能。　　虽然SP主要通过NK细胞表面的相应神经肽受体来介导其生物活性，但这种活化机制大多局限于体外，体内机制国内外研究较少，且缺乏全面系统性，但若将此肽类药物直接用于临床试验会有诸多局限性，如药物在血浆中的浓度范围波动较大或由于代谢迅速而导致难以达到有效血药浓度等。因此，新的药物输送系统，在新药的研发和应用过程中，有越来越重要的地位。纳米给药系统（俗称药物纳米粒）的出现，为解决这些问题提供了可能。药物纳米粒，是近年来药剂学领域研究颇为活跃的一系列新型超微小给药系统的统称，其粒径多在10～500nm之间。由于纳米粒子的微小体积和特殊结构，使之在控、缓释给药，靶向给药，黏膜和局部给药以及基因工程等领域中显示出特殊的优势。因此，研制SP的纳米粒使SP能在体内较长时间存在，有利于观察SP对机体免疫功能的长期作用，其研究结果将对神经肽的临床应用提供新的理论依据。　　方法　　1、采用复乳法制备SP纳米粒①精确称取SP1mg，溶入含0.4％吐温80的500μl双蒸水中。②加入到含2.5％聚乳酸(PLGA)的2ml二氯甲烷溶液中，超声5min使分散形成均一稳定的初乳。③将该乳液在超声条件下加入到8ml2％聚乙二醇(PVA)水溶液中，置于冰水中再分散，形成复乳。④将该复乳液室温下磁力搅拌3h使有机溶剂挥发，得胶体混悬液。将该胶体液以10000转/min，冷冻离心三次，每次10min，沉淀物真空冻干燥得冻干粉，密封后置于4℃保存，即得SP纳米微粒。　　2、SP纳米粒的稳定性质研究取适量SP纳米粒冻干粉超声分散于无水乙醇中，透射电镜下观察微粒形态和大小。同时测量微粒的平均粒径。制备3批SP纳米粒，常规考察其色泽外观及再分散情况。将SP纳米粒冻干粉置于4℃冰箱中，3个月后取出再分散于生理盐水中，观察乳状液的各项指标，了解其稳定性。　　3、SP纳米粒载药率、包裹率的测定新制备的混悬胶体液冷冻离心后收集上清液，用ELISA试剂盒测定上清液中SP的含量，从而得出未被包裹的SP量，进而计算SP纳米粒的载药率和包裹率。　　4、SP纳米粒的体外释药试验精密称取含2μg的SP纳米粒置于离心管中，每个离心管中加入生理盐水至1ml，再置于4℃水浴箱中恒温震荡。按1、2、4、8、12、24、36h定时取样，以ELISA试剂盒测定不同时点的上清液中SP浓度，取样后加入生理盐水恢复原体积。　　5、SP纳米粒的体内释药试验取C57BL/6纯系小鼠，分PBS组、空白颗粒组、SP组、SP纳米粒四组。肌肉注射后，在5、10、15、20、25min各时间点，每组选3只小鼠眼球取血，分离血清，ELISA法检测血清中SP浓度。　　6、CCK8法检测SP对小鼠脾细胞的杀伤活性。　　7、流式细胞术检测SP对小鼠脾细胞功能的影响。　　8、Real-TimePCR法检测SP对小鼠脾细胞杀伤介质（穿孔素、颗粒酶B）和活化受体(NKG2D、NKp46)的mRNA表达的影响。　　实验结果　　1、SP纳米粒的一般性质。　　SP纳米粒胶体悬液混悬透明。透射电镜下，该纳米粒表面光滑，均匀度好，粒径分布均匀，平均粒径50nm。冻干粉为白色疏松粉末。4℃下放置3个月后，冻干粉的再分散性良好，在生理盐水中分布呈混悬胶体状，无沉淀，表明SP纳米粒的稳定性及再分散性良好。　　2、SP纳米粒的平均载药率为1.11％±0.036，平均包裹率为84.37％±3.56。　　3、SP纳米粒的体外释药试验:SP纳米粒在36h内能一直持续释放SP，说明SP具有明显的缓释效果。　　4、SP纳米粒的体内释药试验　　与对照组相比，空白颗粒组血清中SP含量在各时间点内变化不大，SP组和SP纳米粒组在各时间点内血清中SP含量差异显著。其中，SP组在第15min时的血清中SP含量达到最大值，此后量值呈下降趋势;SP纳米粒组在各时间点内的血清SP含量呈稳定上升趋势。　　5、与对照组相比，空白颗粒组中小鼠脾细胞的杀伤活性没有明显差异，其余各组均有明显差异。其中，SP组的中剂量部分较高、低剂量部分的杀伤活性高;纳米高剂量组较纳米中、低剂量组的杀伤活性高。　　6、各组药物连续5天免疫小鼠后，FCAS检测结果表明，SP组（低、中、高浓度）和纳米组（低、中、高浓度）均可增强小鼠脾细胞CD27的表达率。其中，脾脏中的SP低剂量组和纳米粒低剂量组对CD27的影响显著。　　7、SP组（低、中、高浓度）和纳米组（低、中、高浓度）均可显著提高小鼠脾细胞杀伤介质（穿孔素、颗粒酶B）和活化受体(NKG2D、NKp46)的mRNA表达水平。　　结论　　1、SP纳米粒具有易于合成、质量稳定、降解速度可调节等优点。本实验采用复乳法制备SP纳米粒，实验结果表明SP纳米粒球体均匀度好，冻干粉为白色疏松粉末，再分散性良好。　　2、本研究测定了3批次SP纳米粒的载药率和包裹率，结果均相差不大，表明制备工艺有良好的稳定性和可重复性。　　3、SP纳米粒的体内、外释药试验说明SP具有明显的缓释效果。　　4、一定浓度的SP可增强小鼠脾细胞的杀伤活性，并能提高小鼠脾细胞杀伤介质（穿孔素、颗粒酶B）和活化受体(NKG2D、NKp46)的mRNA表达水平以及CD27的表达率，但SP浓度的变化趋势与杀伤活性、mRNA以及CD27表达水平的变化趋势并不完全一致。