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背景与目的miRNA是一类长约22nt的非编码小RNA分子,能够通过与靶基因的3’端非翻译区配对结合引起mRNA的降解或翻译抑制而发挥癌基因或抑癌基因的作用。目前基因组编码的miRNA已超过1000个,约占人类基因的5%左右,而且研究显示近1/3的人类基因受到miRNA的调控。大量的研究报道显示miRNA参与调节包括细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡或坏死等多种生物生命活动过程。值得注意的是,miRNA与人类生命活动和疾病关系密切,尤其是与癌症的发生发展的关系。我们课题组近期比较了恶性转化细胞16HBE-T和对照细胞的miRNA表达谱,发现一簇表达差异的miRNA。而且我们已验证了miR-494、miR-22和miR-106a作为微癌基因参与了anti-BPDE诱导的恶性转化。但是这种恶性转化的预防和治疗的研究却较少,这也是化学致癌中防治癌症的一个关键。化学预防和抗癌的天然药物白藜芦醇具有抑癌和抗癌的作用。有研究表明miRNA参与了白藜芦醇的抗癌过程。本研究即是基于白藜芦醇的抑癌抗癌作用来研究miRNA在肺癌化学致癌、癌症治疗和预防中的作用及机制,探讨miRNA在肺癌预防和治疗中的应用。研究内容与方法:第一部分:小分子RNA miR-622通过调控K-Ras抑制anti-BPDE恶性转化细胞的生长利用miRNA芯片观察恶性转化的16HBE-T细胞给予化学预防和抗癌药物白藜芦醇处理前后的miRNA表达谱变化。利用Trizol试剂提取处理前后的细胞的总RNA,运用实时荧光定量RT-PCR方法验证芯片结果和检测miR-622在16HBE-T和正常16HBE细胞中的表达。运用脂质体转染的方法瞬时导入miR-622模拟物或miR-622的抑制剂使内源性miR-622表达升高或降低。转染miR-622模拟物和miR-622的抑制剂后的16HBE-T细胞用于下游的实验包括细胞增殖(CCK-8方法)、细胞周期(流式细胞仪PI单染方法)、软琼脂集落形成实验和裸鼠荷瘤实验。使用生物信息学预测miR-622的下游靶点,筛选到K-Ras这个靶点。转染miR-622模拟物和miR-622的抑制剂后的16HBE-T细胞,提取总RNA和蛋白,以实时荧光定量RT-PCR和Western-blotting检测K-Ras mRNA和蛋白的表达。以双荧光报告基因表达载体的方法来鉴定miR-622的直接靶点K-Ras。最后16HBE-T细胞预处理K-Ras抑制剂FTS 4天后,再转染miR-622模拟物,通过CCK-8方法和流式细胞仪方法检测细胞增殖和细胞周期的变化。第二部份:小分子RNA miR-497和miR-34a共同靶向cyclin E1调节肺癌细胞的生长第一部份中我们从芯片结果中筛选出miR-497和miR-34a进行功能验证。运用实时荧光定量RT-PCR方法检测人正常支气管上皮细胞16HBE和肺癌细胞株A549、H460、H1299、H446和QG-56中miR-497或miR-34a的表达水平。通过lipofectamine-2000脂质体转染的方法瞬时导入miR-497或miR-34a的模拟物和抑制剂以升高和降低miR-497或miR-34a的表达以进行下游功能的研究。A549、H460和H1299细胞转染miR-497或miR-34a的模拟物或抑制剂后,通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期分布情况。A549细胞转染miR-497或miR-34a的模拟物后,进行软琼脂集落形成实验和裸鼠荷瘤实验。使用生物信息学预测miR-497和miR-34a的靶点,预测到一个共同靶点细胞周期素E1。A549、H460和H1299细胞转染miR-497或miR-34a的模拟物或抑制剂后,提取总RNA和总蛋白进行实时荧光定量RT-PCR和western blotting检测细胞周期素E1的mRNA和蛋白的表达。接着再构建双荧光素酶报告基因载体系统,以荧光素酶活性测定方法来验证miR-497和miR-34a的靶点—细胞周期素E1。以RNA干扰技术干扰CCNE1的表达。A549细胞共转染CCNE1 siRNA和miR-497或miR-34a的模拟物48 h后,通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期分布情况。结果第一部分:小分子RNA miR-622通过调控K-Ras抑制anti-BPDE恶性转化细胞的生长1.白藜芦醇对16HBE-T细胞生长的影响及miRNA表达谱改变12.5-50μM白藜芦醇处理24-48 h诱导16HBE-T细胞增殖抑制,并且呈现剂量和时间依赖,尤其以50μM处理48 h的作用显著。我们进一步对比分析了50μM白藜芦醇处理48 h前后miRNA芯片中miRNA表达的改变,发现735个miRNA中105个miRNA的表达改变显著,其中高表达的miR-150、miR-622、miR-302d、miR-151和miR-98被选取以CCK8的方法检测转染这些miRNA的模拟物后细胞的增殖来预筛选miRNA来进一步研究,结果显示miR-622具有抑制细胞增殖的作用,所以选定miR-622以进一步研究其功能。2. miR-622的表达水平与DMSO溶剂对照组相比,50μM白藜芦醇处理48 h的16HBE-T细胞和H460细胞,miR-622的表达水平均明显上升。而与正常的16HBE细胞相比,16HBE-T和H460细胞中的miR-622表达水平明显降低。转染miR-622模拟物或抑制剂的16HBE-T和H460细胞,miR-622的表达水平明显比转染模拟物NC或抑制剂NC对照高或低。3.转染miR-622模拟物对细胞周期、细胞增殖和软琼脂集落形成的影响与转染模拟物NC对照相比,16HBE-T细胞转染miR-622模拟物,细胞活力降低到72.18%±2.01%,p<0.01。与转染模拟物NC对照(G0期:56.86%±2.01%,S期:28.76%±1.15%)相比,转染miR-622模拟物的16HBE-T细胞周期阻滞于G0期(G0期:68.96%±1.75%,S期:18.05%±1.22%),p<0.01。H460细胞转染miR-622模拟物细胞活力降低,细胞周期也阻滞在G0期。与转染模拟物NC对照组(55±3.3)比较,转染miR-622模拟物组(27.7±6.4,p<0.05)的16HBE-T细胞克隆形成数量明显减少,克隆体积也明显变小。4.转染miR-622模拟物对裸鼠成瘤的影响16HBE-T细胞转染miR-622模拟物组的肿瘤平均体积(0.58±0.14 cm3,p<0.05)和重量(0.18±0.03 g,p<0.05)均比转染模拟物NC对照组的体积(1.09±0.24 cm3)和重量(0.35±0.10 g)要小和轻。5. K-Ras是miR-622的一个靶点应用生物信息软件Targetscan、RNA22和RNAhybrid预测到miR-622的一个靶点—K-Ras。转染miR-622模拟物的16HBE-T细胞中的K-Ras蛋白降低。与共转染双荧光素酶报告基因载体和模拟物NC对照相比,双荧光素酶报告基因载体和miR-622模拟物的共转染后荧光素酶活性明显降低。6. K-Ras参与了miR-622的细胞生长抑制作用K-Ras抑制剂处理后转染miR-622模拟物,细胞增殖抑制被阻滞,细胞周期阻滞的效应基本取消。第二部份:小分子RNA miR-497和miR-34a共同靶向cyclin E1调节肺癌细胞的生长1. miR-497和miR-34a的表达水平第一部份的芯片结果分析,我们发现了白藜芦醇处理后细胞中miR-497和miR-34a处于高表达。而相对于人正常的支气管上皮细胞16HBE,人肺癌细胞株A549、H1299、H460、H446、QG-56和HCC827中miR-497和miR-34a的表达是低表达的。我们在A549、H1299和H460细胞中转染miR-497和miR-34a模拟物,miR-497和miR-34a的表达均明显上升。2.转染miR-497或miR-34a模拟物对细胞周期和细胞增殖的影响与转染模拟物NC对照组相比,A549、H460和H1299细胞转染miR-497模拟物,细胞活力分别减少到65.07%±1.46%、82.94%±1.35%和79.08%±0.20%,p<0.05。而A549、H460和H1299细胞转染miR-34a模拟物,细胞活力分别减少到69.62%±2.01%、44.89%±2.35%和73.01%±6.78%,p<0.05。与转染模拟物NC对照(G0期:61.06%±2.33%,S期:27.50%±2.44%)相比,转染miR-497或miR-34a模拟物的A549细胞细胞周期阻滞于G0期(G0期:82.38%±1.75%,S期:13.67%±3.75%或G0期:78.27%±1.27%,S期:15.72%±1.99%)(p<0.05),S期减少。转染miR-497或miR-34a模拟物的H460和H1299细胞细胞周期也阻滞于G0期。3.转染miR-497或miR-34a模拟物对软琼脂集落形成和裸鼠成瘤的影响与转染模拟物NC对照组(71.0±9.3)相比,转染miR-497或miR-34a模拟物组(31.3±2.4,p<0.05或21.0±4.0,p<0.01)的A549细胞软琼脂克隆形成数量减少,克隆体积明显变小。A549细胞转染miR-497模拟物组生长的肿瘤平均体积(0.59±0.11 cm3)和重量(0.29±0.01 g)均比转染模拟物NC对照组的体积(1.29±0.23 cm3)和重量(0.43±0.07 g)要小和轻(p<0.05)。A549细胞转染miR-34a模拟物组生长的肿瘤平均体积(0.26±0.13 cm3)和重量(0.07±0.01 g)均比转染模拟物NC对照组的体积(0.92±0.64 cm3)和重量(0.27±0.13g)要小和轻(p<0.05)。4. CCNE1为miR-497和miR-34a的一个共同靶点RNA22和RNAhybrid生物信息软件预测到其miR-497和miR-34a共同靶点为CCNE1。A549、H460和H1299细胞转染miR-497或miR-34a模拟物后CCNE1蛋白水平均降低。与共转染荧光素酶报告基因载体和模拟物NC对照相比,荧光素酶报告基因载体和miR-497或miR-34a模拟物的共转染后荧光素酶活性降低到65.44%±1.13%,p<0.01或46.58%±3.16%,p<0.01)。5. CCNE1参与了miR-497或miR-34a的细胞生长抑制作用运用RNA干扰技术干扰CCNE1的表达,CCNE1蛋白和mRNA水平均明显下降。干扰CCNE1后,A549细胞增殖受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,体外软琼脂细胞克隆形成也明显减少。干扰CCNE1后的A549细胞转染miR-497或miR-34a模拟物,细胞增殖抑制被阻滞,细胞周期阻滞作用基本取消。结论1. miR-622抑制16HBE-T细胞的生长、体外软琼脂克隆形成和体内裸鼠成瘤,其机制是通过负性调节K-Ras来介导的。2. miR-497或miR-34a抑制肺癌细胞的生长、体外软琼脂克隆形成和体内裸鼠成瘤,其机制是通过负性调节cyclin E1来实现的。3. miR-622、miR-497或miR-34a等miRNA在白藜芦醇处理后表达增高,miR-622作为抗癌微基因,可以作为肺癌化学致癌的预防和治疗的潜在靶点。miR-34a和miR-497也作为抗癌微基因,具有预防和治疗肺癌的潜力。