油菜是世界重要的油料作物,也是我国具有传统优势的重要油料作物。研究油菜高含油量的机理,有重要的理论价值和广阔的应用前景。柠檬酸合酶与柠檬酸裂解酶都是糖代谢的关键酶,其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物,并可以作为脂肪酸合成的底物,因此,在植物的代谢中与脂肪酸合成紧密相关。研究柠檬酸合酶与柠檬酸裂解酶对脂肪酸合成的影响,以及对种子含油量的贡献,具有一定的理论意义。根据已知的EST序列设计引物,利用现有的油菜cDNA文库及油菜cDNA,本实验成功克隆了油菜柠檬酸合酶、柠檬酸裂解酶A亚基、柠檬酸裂解酶B亚基的序列。分析表明,克隆到的序列含油菜柠檬酸合酶、柠檬酸裂解酶A亚基、柠檬酸裂解酶B亚基的完整开放阅读框。聚类分析表明,三个基因的序列在植物内高度同源。根据克隆的柠檬酸裂解酶A亚基、B亚基和柠檬酸合酶基因(ACLA,ACLB和CS)的cDNA序列,共设计了16对EST引物,其中ACLA 5对,ACLB 5对,CS 6对,用于高低油F2群体和不同含油量品种群体标记。将这些引物用于高低油F2群体,最终有5对引物在群体中有差异条带。将16对引物应用于15个高含油量和15个低含油量的油菜品种群体,有4对引物在群体中有差异条带。实验结果证明设计的EST引物可以用于油菜分子标记。采用半定量PCR和Real-time PCR的方法,检测柠檬酸合酶和柠檬酸裂解酶的表达。结果表明,在含油量不同的油菜品种中,其叶片内柠檬酸合酶表达量有差异,高油品种内表达量较高;在油菜的不同器官和组织中,柠檬酸合酶和柠檬酸裂解酶的表达强度不同,在角果发育早期表达量都较高,随着胚珠的成熟,表达量逐渐下降。在不同的胁迫条件下,油菜叶片中柠檬酸合酶和柠檬酸裂解酶的表达呈现不同的表达规律。柠檬酸合酶在水渍、干旱、高温和低温胁迫下, IAA和6-BA、ABA处理后表达量在特定时期均有上升,同样,柠檬酸裂解酶在水渍、低、强光和ABA处理后在表达量在特定时期均有上升。本实验结果表明,柠檬酸合酶在不同含油量油菜品种叶片中表达强度存在差异。柠檬酸合酶和柠檬酸裂解酶在油菜各器官中广泛表达,而且表达强度存在差异,说明这两个酶是组织和器官发育和执行生理功能不可缺少的。根据克隆的油菜柠檬酸合酶基因,分别构建了油菜柠檬酸合酶基因的顺式植物表达质粒pMD-tCS,pMN-tCS,和反式植物表达质粒pMD-rCS、pMN-rCS,另外成功构建了柠檬酸裂解酶A亚基基因的顺式表达载体Gate-tACLA、反式表达质粒pMD-rACLA、pMN-rACLA。将构建好的植物表达载体转化拟南芥后,经抗性筛选和PCR检测后,除质粒pMN-rCS外,其余得到不同数量的阳性株系。而质粒pMN-rACLA和Gate-tACLA植株尚未进行性状检测。在拟南芥中正义和反义表达油菜柠檬酸合酶基因,均造成了表型的变化。正义表达的植株中,侧枝的生长比野生型旺盛,种子和叶片中含油量均有上升,并且在叶片中尤为明显,此外,种子和叶片的脂肪酸组分也发生了一定的变化。而在反义表达的植株中,出现了矮化、叶片变小、果荚缩短等表型,种子和叶片中含油量降低,组分发生了变化。因此,实验结果表明,柠檬酸合酶在植物的正常生长发育中起重要作用,过量表达和降低表达均会造成植株发育的变化;另外,在植物的脂肪酸合成中,是重要的调控酶,该酶表达的上升会造成脂肪酸合成的增加,反义造成脂肪酸合成的降低。而在拟南芥中,反义表达柠檬酸裂解酶A亚基基因,同样会造成矮化、叶片变小、果荚缩短等表型。反义表达柠檬酸裂解酶,也同样造成了植物脂肪酸合成的降低,说明柠檬酸裂解酶同样是脂肪酸合成的调控酶。