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猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起初生仔猪以呕吐、急性腹泻、严重脱水为特征的一种高度接触性传染病,给养猪业造成巨大的经济损失。临床上,PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)所致疫病的症状极为相似,难以区分,需借助实验室检测加以诊断。建立快速、特异的PEDV、TGEV、PRoV鉴别检测方法,对有效防控猪腹泻类疾病具有重要意义。1.PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用为建立PEDV、TGEV及PRoV的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDVN基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出下限为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV 阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。2.猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用建立PEDV不同毒株的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段,第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRoV、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×102copies/μL;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。总之,本研究成功建立了 2种PEDV的快速检测方法,为临床腹泻病毒的鉴别诊断提供了有效的技术平台。