论文部分内容阅读
第一部分硒酸酯多糖诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究目的 研究硒酸酯多糖对人骨肉瘤细胞在体内外的抑瘤和诱导凋亡作用及对其细胞周期的调控。方法 分别采用0、30、60、120μg/ml硒酸酯多糖干预人骨肉瘤细胞株(OS-732)1、2、4、6天后MTT法在酶联免疫检测仪测光吸收值,绘制细胞生长曲线,计算细胞抑制率。并与酯多糖抑瘤率比较。形态学观察:荧光染色法,采用丫碇橙(AO)与溴化乙啶(EB)双重染色法染色上述硒酸酯多糖干预后的骨肉瘤细胞,在荧光显微镜下观察早期、晚期凋亡细胞的形态,计算细胞凋亡率。透射电镜下观察作用后早、晚期凋亡细胞。采用碘化丙啶(PI)染色药物作用后的骨肉瘤细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡比例及细胞周期。提取硒酸酯多糖干预后骨肉瘤细胞株DNA,Agarose电泳观察细胞DNAladder形态。2×107人骨肉瘤细胞株接种于3组各7只4周龄裸鼠皮下,次日起腹腔给予生理盐水、低浓度组(4mg/kg/d)、高浓度组(40mg/kg/d)硒酸酯多糖×10天,6周后处死,测瘤重和移植瘤体积,计算抑瘤率。肿瘤组织采用原位 DNA断裂位点末端标记(TUNEL法),计算凋亡指数,比较组间差异。结果 1.硒酸酯多糖作用于人骨肉瘤细胞株1、2、4、6天后,细胞生长明显受抑制,生长曲线表现为下降趋势,与对照组比较统计学上有显著性差异。肿瘤细胞生长抑制率呈现药物浓度和时间依赖性。抑瘤率明显高于酯多糖,表明硒是其有效作用成分。2.硒酸酯多糖作用于骨肉瘤细胞株24小时后,经AO、EB双重染色荧光显微镜下可见早期凋亡细胞,随着作用浓度和时间增加,早期凋亡细胞数量增加,并出现晚期凋亡细胞。凋亡率呈时间、剂量依赖性。硒酸酯多糖120μg/ml作用骨肉瘤细胞48小时后透射电镜可观察到早、晚期凋亡细胞。3. FCM检测到30μg/ml硒酸酯多糖作用细胞12小时后即可见G1峰前出现亚二倍体峰,肿瘤细胞凋亡率为6.82%,60μg/ml组细胞凋亡率为13.26%,120μg/ml组细胞凋亡率为17.86%,对照组凋亡率为0。差异有统计学意义(P<0.05);凋亡率随作用时间增加而上升。细胞周期分析显示药物作用组S期比例明显增加,G2~M期比例明显减少,表明细胞受阻于S期。 <WP=6>4.细胞DNAladder实验显示 30、60、120μg/ml作用骨肉瘤细胞株24小时后凝胶电泳出现DNAladder形态。5.体内实验显示骨肉瘤细胞接种裸鼠皮下后2周成瘤,6周时3组裸鼠成瘤体积、重量有显著性差异;低硒组抑瘤率(%)为48.8±14.85,高硒组为83.9±7.46(P<0.01)。肿瘤组织经TUNEL染色后显示低浓度组凋亡阳性率为71.4%(5/7),高浓度组为100% (7/7),对照组为57.1%(4/7)。各组凋亡指数(AI)治疗组明显强于对照组。第二部分硒酸酯多糖抑制人骨肉瘤细胞转移的实验研究目的 研究硒酸酯多糖对人骨肉瘤细胞体外趋化、侵袭运动的影响,及对体内转移能力的抑制作用。方法 硒酸酯多糖对人骨肉瘤细胞体外趋化运动的影响:0、7.5、15、30、60、120μg/ml浓度组的硒酸酯多糖与OS-732细胞预孵育24h,重新计数后加入预铺Fn的Transwell培养板,37℃、5%CO2孵育24h,滤膜姬姆萨染色,计穿膜细胞数。硒酸酯多糖对人骨肉瘤细胞体外侵袭的影响:以上各组浓度硒酸酯多糖与OS-732细胞预孵育24h,重新计数后加入预铺Matrigel Matrix的Transwell培养板,孵育24h后,滤膜姬姆萨染色,计侵袭细胞数。硒酸酯多糖抑制人骨肉瘤细胞转移的体内实验:采用对数增殖期的OS-732细胞株接种于4周龄裸鼠皮下,不同浓度组硒酸酯多糖(剂量同第一部分)腹腔给药10天,裸鼠于接种后6周处死,取皮下移植瘤组织,利用抗CD34免疫组化方法检测肿瘤组织中微血管密度(MVD),比较组间差异。另取一部分组织戊二醛固定后作透射电镜观察,从侵袭、转移能力分析各组肿瘤细胞骨架等超微结构变化。取各组裸鼠肺组织石蜡包埋,切片,HE染色后检测肺转移灶的发生率。结果 体外细胞趋化实验结果显示:骨肉瘤细胞经硒酸酯多糖作用后运动能力下降,120μg/ml浓度组穿膜细胞数由对照组50.82±3.22/ 每视野(×200)减为8.45±1.25/ 每视野(×200)(P<0.01)。随浓度增加,穿膜细胞数逐渐减少,呈剂量依赖性,各组差异有显著统计学意义(P<0.01)。体外侵袭实验结果显示:经硒酸酯多糖作用24h后,细胞侵袭力下降,出项明显的侵袭抑制作用,并呈剂量依赖性。当药物浓度>30μg/ml,抑制效应非常明显,与对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。裸鼠皮下移植瘤组织MVD(×200)计数对照组、低硒组(4mg/kg/d)、高硒组(40mg/kg/d)分别为64.58±11.86、40.19±9.45、18.73±7.52,高硒组与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。透射电镜显示经药物干预后的骨肉瘤细胞变圆整,伪<WP=7>足减少,间隙变小,内质网增多等超微结构改变,表明侵袭力减弱。肺组织切片观测肿瘤肺转移率为57.1%(4/7)、14.3%(1/7)、0%(0/7),用药组与对照组比有统计学意义(P<0.05)。 第三部分硒酸酯多糖诱导骨肉瘤细胞凋亡及抑制转移的分子学基础目的 进一步探讨硒酸酯多糖诱导人骨肉瘤细胞凋亡及抑制转移的分子生物学机制。方法 硒酸酯多糖对人骨肉瘤细胞凋亡相关基因的调控:0、30、60、120μg/ml硒酸酯多糖作用OS-732细胞24h后行细胞RNA抽提,逆转录后半定量PCR(