背景与目的人结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,近年来发病率逐渐增加,肿瘤细胞的侵袭转移,尤其是肝脏转移是导致结直肠癌具有较高死亡率的主要原因之一。因此,对于结直肠癌侵袭转移的研究是目前研究的重点和难点。NF-κB信号通路是机体内最活跃的信号通路之一,目前发现有经典活化通路和非经典活化通路两条途径,均参与了结直肠癌从发生发展到远处转移的每一个步骤,并与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、TNF-α、PI3K/Akt、Wnt信号通路有关。NIK和IKKβ连接蛋白(NIK and IKKP binding protein, NIBP)是新近发现的一种NF-κB信号通路调节蛋白,通过直接连接NIK和IKKβ在细胞因子刺激诱导的经典NF-κB信号通路活化过程中发挥关键作用。近年来NIBP在多种恶性肿瘤组织中被发现与肿瘤发生发展有关,NIBP可能成为评估肿瘤进展和肿瘤治疗的新靶点,但其在人结直肠癌侵袭转移中的作用及其机制却少见报道。本研究将通过临床病理组织、离体细胞实验及裸鼠体内实验三个层面探索NIBP在人结直肠癌侵袭转移中的作用及其对NF-κB信号通路活化以及MMP2和MMP9表达的影响。材料和方法1.临床标本：收集广西医科大学第一附属医院结直肠外科结直肠癌组织标本114例及消化内科内镜诊疗部肠镜活检的结直肠腺瘤组织标本21例。采用免疫组化(Immuno histochemistry, IHC)法检测临床组织标本中的NIBP、p-p65、MMP2和MMP9的表达,使用改良的免疫反应评分(IRS)对NIBP、p-p65、MMP2和MMP9的表达进行定量分析,评估结直肠癌的TNM分期,同时收集结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的病理类型、所在部位、直径及转移情况的临床资料,对NIBP、p-p65、MMP2和MMP9与肿瘤TNM分期以及其他临床资料的关系进行分析比较,Pearson相关性分析检测NIBP与p-p65、MMP2和MMP9表达的相关性。2.构建NIBP过表达的HT29细胞株：通过化学合成全基因,酶切载体,重组pcDNA3.1 (+) NIBP过表达载体,转化至感受态细胞,提取质粒后进行酶切鉴定和测序验证。慢病毒介导过表达载体转染HT29细胞,Blasticidin筛选稳定转染株,qPCR及Western Blot验证转染效果。3.构建NIBP低表达的HCT116细胞株：设计合成3个NIBP干扰靶点序列,退火连接线性miRNA载体与oligo双链并转化至感受态细菌后提取质粒,酶切及重组pLenti6.3-EGFP-NIBP-miR NIBP干扰低表达载体,转化至感受态细胞,提取质粒后进行酶切鉴定和测序验证。慢病毒介导干扰低表达载体转染HCT116细胞,Blasticidin筛选稳定转染株,qPCR及Western Blot验证转染效果及干扰效率,选择效率最高的干扰载体进行后续实验。4.不同NIBP表达的人结直肠癌细胞株体外迁移和侵袭能力检测：分别选用未转染的HT29细胞、HT29 NC细胞、稳定高表达NIBP的HT29细胞、未转染的HCT116细胞、HCT116 NC细胞和稳定低表达NIBP的HCT116细胞作为研究对象,采用Transwell小室检测各组细胞迁移和侵袭能力变化。5.不同NIBP表达的人结直肠癌细胞株体内转移能力的检测：建立裸鼠原位移植瘤模型,分别将未转染的HT29细胞、稳定高表达NIBP的HT29细胞、未转染的HCT116细胞和稳定低表达NIBP的HCT116细胞分别接种至裸鼠皮下,成瘤后将瘤体取出,剪成小块并种植至裸鼠盲肠,观察4-6周后处死裸鼠,解剖观察原包埋瘤块与周围肠壁的关系及肝脏的转移情况,留取瘤体标本进行后续实验。6. NIBP与经典NF-κB信号通路活化、MMP2和MMP9表达的关系以及对细胞迁移侵袭能力的影响：选取未转染的HT29细胞、HT29 NC细胞、稳定高表达NIBP的HT29细胞、未转染的HCT116细胞、HCT116 NC细胞和稳定低表达NIBP的HCT116细胞进行实验,分别应用经典NF-κB信号通路抑制剂PDTC (5μg/mL)分别对未转染的HT29细胞和NIBP稳定高表达的HT29细胞进行干预48h。同时应用经典NF-κB信号通路激活剂TNF-a (20ng/mL)分别对未转染的HCT116细胞和NIBP稳定低表达的HCT116细胞进行干预48h。应用Western Blot检测经典NF-κB信号通路下游因子p65和IκBβ及各自磷酸化形式以及MMP2、MMP9的表达水平；应用Transwell小室检测各组细胞在体外的迁移和侵袭能力。7.不同NIBP表达水平的细胞在裸鼠肝转移灶中与经典NF-κB信号通路活化以及MMP2、MMP9表达的关系：采用免疫组化法检测裸鼠原位移植瘤实验肝转移灶中p-p65、MMP2和MMP9的表达水平。8.统计学分析方法：采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对多组间计量资料进行比较,先进行方差齐性分析,若方差齐则采用Bonferroni检验；若方差不齐,则采用Dunnctt’s T3法检验。两组间计量资料采用两独立样本t检验进行比较。计数资料采用Fisher’s确切概率法检测。用Pearson相关性分析法检测NIBP免疫组化评分与其他指标免疫组化评分的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.临床组织标本中NIBP、p-p65、MMP2和MMP9的表达以及与临床病理的关系：本研究共收集21例结直肠管状腺瘤组织标本和114例人结直肠癌组织标本,其中TNMⅠ期19例,TNM Ⅱ期44例,TNM Ⅲ期30例,TNM Ⅳ期21例；管状腺癌93例,粘液腺癌21例。在存在远处转移的结直肠癌患者中,发现肝转移12例(57.14%),其他器官转移9例,其中腹膜及腹腔内转移8例(38.10%),肺转移1例(4.76%)。在结肠腺瘤组织、TNM Ⅰ期和TNM Ⅱ期结直肠癌组织中,NIBP和p-p65 IRS相似,差异无统计学意义(P>0.05),两者在TNM Ⅲ期和TNM Ⅳ期结直肠癌组织中分别较结肠腺瘤、TNM Ⅰ期和TNM Ⅱ期结直肠癌组织明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而TNM Ⅲ期和TNM Ⅳ期的NIBP IRS则相近,差异无统计学意义(P>0.05)；但p-p65 IRS在TNM Ⅳ期中较TNM Ⅲ期明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。MMP2 IRS在TNM Ⅰ期和TNM Ⅱ期结直肠癌组织中相似,MMP9 IRS则在TNM Ⅰ期和结肠腺瘤组织中相似,差异均无统计学意义(P>0.05); MMP2和MMP9在TNM Ⅲ期结直肠癌组织均较结肠腺瘤、TNM Ⅰ和TNM Ⅱ期结直肠癌组织明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；TNM Ⅳ期结直肠癌组织的MMP2和MMP9 IRS稍有下降,但仍然较结肠腺瘤组织和TNM Ⅰ期结直肠癌组织明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。管状腺瘤的NIBP、p-p65、MMP2和MMP9 IRS最低,差异有统计学意义(P<0.05)：而不论是管状腺癌还是粘液腺癌,NIBP、p-p65、 MMP2以及MMP9 IRS均较高,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。然而,p-p65、MMP2和MMP9 IRS在不同性别、部位及肿瘤直径的比较中均无差别,差异无统计学意义(P>0.05),而NIBP IRS虽然在不同性别和部位的结直肠癌组织中相近(P>0.05),但是在肿瘤直径小于2cm的组织中明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在出现肝转移组的NIBP和p-p65 IRS较淋巴结转移组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),但是和其他器官转移组相比增加不明显,差异无统计学意义(P>0.05)；而MMP2和MMP9在所有转移的组织中均无明显差别(P>0.05)。2.成功构建NIBP过表达的HT29细胞株：化学合成NIBP全基因,酶切并重组pcDNA3.1 (+) NIBP过表达载体,转化至感受态细胞,提取质粒后进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳证实NIBP目的基因分子量正确,基因测序验证成功。慢病毒介导过表达载体转染HT29细胞, Blasticidin筛选稳定转染株,qPCR及Western Blot验证转染的HT29细胞中NIBP基因及蛋白表达均明显增加,说明构建NIBP稳定过表达HT29细胞株成功,命名为HT29+NIBP株；转染空质粒的细胞株则命名为HT29+NC株,以便后续实验。3.成功构建NIBP低表达的HCT116细胞株：按照设计的3个干扰序列,酶切及重组pLenti6.3-EGFP-NIBP-miRNIBP干扰低表达载体,转化至感受态细胞,提取质粒后进行酶切鉴定。通过慢病毒介导干扰低表达载体转染HCT116细胞,Blasticidin筛选稳定转染株。qPCR检验证实靶点序列为GGAAGCTGTCCTGAATTTCAA的干扰效率最高,命名为HCT116+NIBP shRNA株,转染空质粒的细胞则命名为HCT116+NC株,以便进行后续实验。4. NIBP调控人结直肠癌细胞株体外迁移及侵袭能力：通过Transwell小室检测发现,未转染的HT29细胞和HT29+NC细胞的迁移和侵袭能力均较低,而在HT29+NIBP细胞中,迁移和侵袭能力均明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)；未转染的HCT116细胞和HCT116+NC细胞迁移和侵袭能力均较强,而HCT116+NIBP shRNA细胞的迁移和侵袭能力均明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。5. NIBP影响人结直肠癌细胞株在裸鼠原位移植瘤肝转移的能力：未转染的HT29细胞组中仅有1只裸鼠出现肝脏转移灶(1/5)；HT29+NIBP细胞则有4只裸鼠发现肝脏转移灶(4/6),虽然例数较未转染的HT29裸鼠有所增加,但两组裸鼠的肝脏转移率相似,差异无统计学意义(P>0.05)；两组的原位移植瘤的瘤体重量亦无明显差异(P>0.05)。未转染的HCT116细胞接种裸鼠后每一只均发现肝脏转移灶(4/4)；HCT116+NIBP shRNA细胞接种的裸鼠中仅有1只出现肝脏转移灶(1/6),肝脏转移率较未转染的HCT116裸鼠明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),同时HCT116+NIBP shRNA细胞裸鼠的原位移植瘤瘤体重量较未转染的HCT116细胞裸鼠偏低(P<0.05)。6. NIBP的表达增加能促进经典NF-κB信号通路活化、MMP2和MMP9表达进而增强细胞的迁移侵袭能力：在未转染的HT29细胞和HT29+NC细胞中,p65和IκBβ及其各自的磷酸化形式表达量相似,MMP2和MMP9表达量均较低,应用5μg/mL PDTC干预细胞48h后,未转染的HT29细胞中总体p65和IκBβ表达与其他细胞组相似,而磷酸化的p65和IκBβ以及MMP2和MMP9表达则明显降低；而HT29+NIBP细胞中p65和IκBβ的磷酸化表达及其总量,MMP2和MMP9表达均明显增加；但在PDTC干预HT29+NIBP细胞后,其磷酸化的p65和总p65表达与未经PDTC干预的HT29+NIBP细胞相似,磷酸化的IκBβ和总IκBβ表达以及MMP2和MMP9表达也有相似的结果。通过Transwell小室检测发现,HT29+NIBP细胞的迁移和侵袭细胞数量最多,PDTC能减少未转染的HT29细胞的迁移和侵袭数量,但在HT29+NIBP细胞中作用不明显,差异则均有统计学意义(均P<0.05)。7.降低NIBP表达能抑制经典NF-κB信号通路活化、MMP2和MMP9表达进而降低细胞的迁移侵袭能力：在未转染的HCT116细胞和HCT116+NC细胞中,总的p65和IκBβ表达量及其磷酸化表达量均相似,MMP2和MMP9表达量较高；应用20ng/mL TNF-α干预细胞48h后,未转染的HCT116细胞中总体p65和IκBβ表达与其他细胞组相似,而磷酸化的p65和磷酸化的IκBβ表达量以及MMP2和MMP9的表达则明显升高；而HCT116+NIBP shRNA细胞中磷酸化的p65和IκBβ表达量以及MMP2和MMP9均明显降低,但总的p65和IκBβ表达量无明显变化；即使在TNF-α干预48h后,HCT116+NIBP shRNA细胞磷酸化的p65和IκBβ及其总量的表达与未经TNF-α干预的HCT116+NIBP shRNA细胞相似,MMP2和MMP9的表达也出现同步下降。未转染的HCT116细胞迁移和侵袭能力较强,OD590nm较高,应用TNF-α干预48h后,OD590nm均进一步升高,与未转染的HCT116细胞和HCT116+NC细胞相比差异均有统计学意义(均P<0.05)；而HCT116+NIBP shRNA细胞中OD590nm明显下降,使用TNF-α干预后,OD590nm依然处于较低水平,与未干预的HCT116+NIBP shRNA细胞相似,差异无统计学意义(P>0.05)。8. NIBP在人结直肠癌细胞裸鼠原位移植瘤肝转移灶中调节经典NF-κB信号通路活化、MMP2和MMP9的表达：通过裸鼠原位移植瘤实验发现,HT29+NIBP细胞在肝脏形成的转移灶中p-p65.MMP2和MMP9的IRS均较未转染细胞形成的要高；而HCT116+NIBP shRNA细胞的肝转移灶p-p65、MMP2和MMP9的IRS均较低。结论1.NIBP在晚期结直肠癌中表达明显增加,并与结直肠癌的肝转移有关,可能是预测结直肠癌转移的一个重要指标。2. NIBP通过调节经典NF-κB信号通路的活化,引起MMP2、MMP9表达改变,进而在体外调节人结直肠癌细胞的侵袭转移能力；并有可能通过上述途径在癌细胞的体内转移过程中发挥一定作用。