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醛酮还原酶AKR1C2是一种肿瘤基因相关蛋白,正常组织含量极少,当癌症发生时,AKR1C2含量升高,因此醛酮还原酶AKR1C2在生物体内的表达、超表达,可作为长期反应癌症发展水平的一项标准,是监测癌症发生、发展的重要指标。通过免疫学手段,建立起的针对醛酮还原酶AKR1C2的检测方法,为肿瘤的早期发现及治疗提供了新的研究方向。 本文利用大肠杆菌表达系统表达醛酮还原酶AKR1C2基因。构建表达载体pET-15b-AKR1C2并转化至大肠杆菌 BL21感受态细胞。之后对其进行表达,对表达产物进行 SDS-PAGE检测,实验组出现一条大约37kD条带。优化可溶性目的蛋白表达条件,选择诱导时间10 h、诱导温度20℃、诱导剂浓度0.8 mM、转接量1:30作为最适蛋白表达条件,蛋白含量由未经优化前的5.45 mg/mL提高到9.50 mg/mL。优化作用明显,提高了可溶性目的蛋白表达量。在最优表达条件下表达蛋白并进行纯化,得到目的蛋白单一条带,杂蛋白被除去,纯度在98%以上。用获得目的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和BALB/c小鼠,获取兔源和鼠源的AKR1C2抗体,测定效价约为1:60000,并建立双抗夹心的AKR1C2测定方法。通过对其酶活力进行测定,醛酮还原酶AKR1C2对体内激素类羰基化合物甲睾酮、孕酮的催化活性较低,对外源化合物苯甲醛、对苯醌有中等的催化活性,对丙二醛、丁烯醛、甘油醛有较高的催化活性。选择甘油醛作为 AKR1C2最适底物,摸索最佳催化条件,当酶含量为0.5 mg,底物浓度为1.0 mM,反应时间为7-9min,反应pH范围在7.2-7.4,水浴温度37℃。AKR1C2活性最大,并在有Mn2+存在时,可以提高催化活性。