合格的食用油中是不会含有辣椒碱,而地沟油大部分都是餐饮废弃油,如果在烹饪过程中加入了辣味调料等物质,尤其是牛油火锅中,则油脂中一定会有辣椒碱物质的存在。因为辣椒碱的自身具备的一些特性例如亲脂、稳定和沸点高,这些特性决定了即使精炼地沟油也很难分离出辣椒碱,因此可以将辣椒碱作为鉴别食用油是否为地沟油的特异性指标。因此,本文建立了三种不同的免疫侧向层析法来检测食用油中的辣椒碱:(1)传统型免疫侧向层析试纸食用油中辣椒碱检测方法的建立本方法的原理在于毛细管侧向层析和抗原抗体免疫识别相结合,利用抗体可以通过静电吸附与纳米金粒子表面偶联结合,NC膜上的C线上固定羊抗鼠二抗,T线上固定辣椒碱抗原,一般通过NC膜上T线和C线是否显色来判断食用油中辣椒碱的存在情况,同时与灰度扫描结果结合来对辣椒碱的含量进行定量分析。在可行性研究的基础上优化金纳米粒子与抗体偶联量、偶联p H、重悬液、样品垫处理液和上样稀释缓冲液,得出最佳实验方案,并检测传统型辣椒碱试纸条的特异性和灵敏度。在最佳实验条件下,可以在10 min内完成对辣椒碱含量的检测。肉眼观察试纸条的灵敏度为100μg/L,标准曲线检测线性范围为10-100μg/L。(2)改良型免疫侧向层析试纸食用油中辣椒碱检测方法的建立本方法是在传统免疫侧向层析试纸检测的基础上将金标垫舍弃,将金标偶联产物滴入96孔板微孔中进行冷冻干燥,实验对冷冻干燥物和上样液的预孵育的时间优化得出最佳实验方案,同时优化金纳米粒子和辣椒碱抗体偶联量、封闭液的选择、重悬液的选择和96孔板微孔中滴加量,并检测冷冻干燥型辣椒碱试纸条灵敏度。在最佳实验条件下,对辣椒碱的检测在15 min内完成,裸眼观察灵敏度为10μg/L,相比于传统方法提高了10倍。标准曲线线性范围为2.5-50μg/L。(3)时间分辨荧光微球标记免疫侧向试纸辣椒碱检测方法的建立本方法是基于竞争法免疫侧向层析试纸检测原理,用时间分辨荧光微球标记辣椒碱抗体建立免疫侧向层析试纸,对食用油中辣椒碱进行快速准确检测。时间分辨荧光微球比表面积大、同时荧光微球表面修饰了一定数量的羧基功能团,可以有效地将蛋白或抗体表面的氨基和荧光微球表面的羧基通过共价结合偶联在一起,提高了标记过程的稳定性。本方法是在时间分辨荧光微球表面标记辣椒碱单克隆抗体,NC膜的T线上固定辣椒碱抗原,C线上固定羊抗鼠二抗,通过肉眼可以看出NC膜上的T线和C线是否显色从而来定量分析食用油中辣椒碱的含量。本实验对荧光微球与辣椒碱抗体的偶联量、封闭剂种类、重悬液种类和荧光微球偶联时的缓冲液体系进行优化从而确定最优实验参数,并检测时间分辨荧光微球辣椒碱试纸条的特异性和灵敏度。在最优实验条件下,可以在10 min内完成对辣椒碱的检测,肉眼直接观察的灵敏度为20μg/L,标准曲线的线性检测范围为2.5-50μg/L。因此可以看出利用时间分辨荧光微球进行标记抗体建立的免疫侧向层析试纸检测的灵敏度和稳定性不输于传统金纳米粒子标记,为下一步时间分辨荧光微球在免疫侧向层析试纸上的后续应用奠定了一定的基础。