流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病.乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）与西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、圣路易脑炎病毒（Saint-Louis encephalitis virus,SLEV）和墨累河谷脑炎病毒（Murray Valley encephalitis virus,MVEV）同属一个血清群。上述病原可导致严重的公共卫生问题,而且其中的两种或多种病原往往在同一地区流行,加之它们在血清学上存在严重的交叉反应,所以建立起针对上述病原的快速、可靠的鉴别诊断方法十分必要。本研究以本实验室保存的SA14-14-2株NS1基因进行密码子优化后,由人工合成,将NS1基因分别亚克隆至原核表达载体pET-30和pMAL-c5X构建出重组质粒pET-30-opti-NS1和pc5X-opti-NS1。将pET-30-opti-NS1重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导表达后,将表达产物纯化作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠;经过免疫、融合、筛选等过程,共获得16株特异性针对NS1蛋白的单克隆抗体,IFA表明其中8株能识别天然状态下的NS1蛋白;将pc5X-opti-NS1重组质粒验证连接正确后转化大肠杆菌感受态细胞ER2523,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示重组的NS1蛋白在原核表达系统中得到大量表达,并部分以可溶形式存在。Western blot和间接ELISA检测表明该重组NS1蛋白能与猪JEV阳性血清发生特异性反应。以pc5X-opti-NS1表达的MBP-NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。设计一套包含整个NS1蛋白的51个短肽片段,每个肽段长度为16aa,每两个相邻的短肽之间有8aa的重叠。为表达这些短肽,首先人工合成了表达它们的基因,在编码链的5’端引入BamHI位点,3’端引入XhoI位点。这51个肽段经IPTG诱导后得到了表达,表达产物与制备的单克隆抗体100816-10F7、100816-8B5、100910-1E8、100816-7G1、100816-4E3、100910-6D8作用,ELISA结果与单抗100816-10F7、100816-8B5、100910-1E8、100816-7G1、100816-4E3、100910-6D8呈现明显的阳性反应,由此可以判定单抗的抗原表位,分别将该区域逐一氨基酸截短表达后与对应单抗反应,结果表明⁵AIDITRK¹¹、⁷²RDELNVL⁷⁸、²²⁷ETHTLW²³²、²⁵¹KSKHNRREGY²⁶⁰、²⁶⁹DENGIVLD²⁷⁶、³⁴¹DETTLVRS³⁴⁸序列为该表位的核心序列。