论文部分内容阅读
目的：建立CT26-Smad4KD稳定细胞系并对其进行鉴定。方法：选用小鼠结肠癌细胞系CT26作为研究对象。以已被文献验证的有效shRNA序列为干扰序列并使用通用阴性对照序列，分别构建vshRNA载体。转染293T细胞包被慢病毒颗粒。在野生型CT26细胞系中，采用慢病毒感染的方式建立Smad4干扰组以及相应的空载体对照组。使用puromycin筛选获得阳性细胞克隆。以western blot和Co-immunoprecipitation检测上述细胞克隆中Smad4蛋白的表达情况及Smad2/3/4复合物的形成情况。并对非Smad通路中MAPK通路进行初步检测。结果：在含polybrene5μ g/ml的RPMI-1640培养基做溶媒，MOI=50时，慢病毒在CT26细胞感染效率最高。经western blot检测，野生型CT26细胞和阴性对照克隆均正常表达Smad4，干扰组中，Smad4KD#1、Smad4KD#8和Smad4KD#18克隆的Smad4表达下降明显，干扰效果好。经Co-immunoprecipitation检测，无论是否给予外源性TGF-β，CT26-Smad4KD细胞系均不能形成正常水平的Smad2/3/4复合物。结论：成功建立CT26-Smad4KD细胞系及其阴性对照。目的：探讨Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞增殖中的作用。方法：选用小鼠结肠癌细胞系CT26、其阴性对照NC及敲减Smad4的细胞系CT26-Smad4KD作为研究对象。通过CCK-8实验，观察及比较野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的生存曲线，以及在给予外源性TGF-β条件下，其细胞增殖能力。然后，通过软琼脂糖克隆形成实验，检测野生型CT26细胞在敲减Smad4蛋白后，其在半固态悬浮环境中的非锚定增殖能力。接下来，我们使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡实验在流式细胞仪上比较野生型CT26细胞干扰Smad4蛋白前后，在细胞凋亡的改变。最后，我们在Balb/c-nu鼠进行了体内实验。我们将野生型CT26与Smad4KD细胞分别注射到Balb/c-nu鼠皮下，观察其体内成瘤能力。结果：CCK-8实验结果表明，在未给予外源性TGF-β条件下，干扰Smad4后，CT26细胞的增殖能力在第48h开始，较野生组和阴性对照组有明显降低；而阴性对照组与野生型则呜显著差异。干扰Smad4后，CT26细胞的增殖能力下降了约25%，而阴性对照NC组无明显变化。而给予外源性TGF-β刺激时，野生型CT26、阴性对照NC组及Smad4KD三组细胞之间增殖无显著性差异。Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞CT26的增殖中起促进作用，并且干扰Smad4蛋白之后，细胞对外源性TGF-β的生长抑制效应失去应答。然后，软琼脂克隆形成实验结果表明，敲减Smad4的小鼠结肠癌细胞CT26的克隆形成明显比野生型及阴性对照组的细胞少，而且所形成的克隆直径也小于野生型和阴性对照组。AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡实验提示，与野生型CT26及其阴性对照组相比，Smad4KD细胞活细胞百分比明显降低，早其凋亡及死亡细胞显著增加。而给予外源性TGF-β之后，野生型CT26细胞、阴性对照及Smad4KD细胞的凋亡细胞百分比未有明显变化。而皮下成瘤体内实验提示，与野生型CT26细胞所成皮下肿瘤相比，Smad4KD形成的皮下瘤块明显较小。野生型CT26所成皮下肿瘤体积为5865.731630.00mm3，而Smad4KD所成皮下肿瘤体积为955.37297.96mm3。干扰Smad4使CT26细胞所形成的皮下肿瘤体积显著减小。结论：干扰Smad4抑制CT26细胞增殖及克隆形成，促进其凋亡。目的：探讨Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞转移表型中的作用。方法：我们以小鼠结肠癌细胞CT26、阴性对照细胞及CT26-Smad4KD细胞作为研究对象，利用划痕实验、transwell细胞迁移及细胞侵袭实验，评估野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的横向爬行能力、纵向迁移及侵袭能力。然后，我们结合TGF-β与MAPK/JNK抑制剂SP600125，以及MAPK/ERK抑制剂PD98059和U0126，使用transwell细胞迁移实验研究Smad4KD细胞在阻断JNK或ERK通路后，其纵向迁移能力的变化。结果：划痕实验结果表明，划痕36小时后，给予外源性TGF-β后，野生型CT26细胞向无细胞区爬行增多；而Smad4KD细胞在未给予外源性TGF-β条件下，其细胞侧向爬行能力已经明显超过野生型CT26细胞，给予外源性TGF-β刺激后，爬行能力明显增强。此后，transwell细胞迁移实验结果表明，铺细胞24小时后，野生型CT26细胞每个高倍视野下，穿过8um的transwell膜细胞数目为23.413.13个，两个阴性对照克隆穿过数分别为24.4311.43和23.8515.89个。而敲减Smad4后，其穿过能力明显增强，三个Smad4KD细胞克隆的穿过数目分别为258.1436.40，204.5744.77与249.1447.88个（p<0.05）。使用MAPK/JNK或MAPK/MEK抑制剂能减弱Smad4KD细胞增强的迁移能力。结论：干扰Smad4促进CT26细胞的运动性及侵袭能力。Smad4下调引起的侵袭表型可以被JNK和ERK通路抑制剂减弱。