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肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,近二十年来,我国HCC的死亡率增加了41.7%,约占全世界HCC死亡人数的42%。目前,手术切除仍是治疗HCC的最佳手段,但本病起病隐匿,病情发展迅速,大多数患者就诊时已发展到中晚期,失去了手术治疗的机会,患者5年生存率低于10%。环氧合酶(cylooxygenases,COX)和脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是体内催化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)代谢的两个关键酶。细胞膜上的磷脂在磷脂酶A2作用下释放出AA,AA经COX和LOX两条通路代谢产生一系列的生物活性物质,如前列腺素(PG)、血栓烷素A2 (TXA2)、羟基廿碳四烯酸(HETES)和白细胞三烯(LTS)等。通过这些活性物质,COX及LOX影响细胞信号转导及代谢,进而对包括肿瘤,炎症在内的多种疾病产生作用。NS-398是一种选择性COX-2抑制剂,与传统的非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDS)不同的是其抑制COX-1的作用非常弱,从而减轻了胃肠道的不良反应。目前其已被发现能够抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞周期阻滞。LOX抑制剂NDGA对于人肝癌细胞株HepG2细胞具有明显生长抑制作用,同时还可以诱导HepG2细胞凋亡,引起细胞周期被阻滞于G1/S期。本研究选用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,探讨NS-398和NDGA联合应用对人肝癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及对bcl-2mRNA表达的影响,为将NS-398和NDGA联合应用于HCC的治疗提供初步的实验依据。目的:探讨单独和联合应用选择性环氧合酶-2抑制剂(cyclooxygenase-2 selective inhibitor) NS-398和脂氧合酶抑制剂(lipoxygenase inhibitor)NDGA对于人肝癌细胞株HepG2的增殖、凋亡和对bcl-2mRNA表达的影响。方法:(1)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测单独及联合应用NS-398和NDGA对于人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用并应用金正均法判断两药的相互作用。(2)采用DNA末端原位标记染色法(TUNEL法)观察药物作用后人肝癌细胞株HepG2的形态学改变并计算凋亡指数(apoptosis index, AI)。(3)采用流式细胞术检测药物作用后人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡率。(4)采用RT-PCR检测药物作用后人肝癌细胞株HepG2中bcl-2 mRNA的表达。结果:(1) MTT结果显示NS-398 (20160μmol/L)或NDGA (25200μmol/L)单独应用对人肝癌细胞株HepG2均有增殖抑制作用,药物浓度越高,抑制作用越强,呈现明显的剂量效应关系。系列浓度NS-398或NDGA作用于细胞24h、48h、72h后观察细胞的生长情况,结果显示NS-398或NDGA作用时间越长,对上述细胞的抑制作用越强,呈明显的时间效应关系。依据金正均法NS-398在20160μmol·L-1浓度范围内与NDGA 25100μmol·L-1浓度范围内及NS-398 20μmol·L-1与NDGA 200μmol·L-1联合应用显示出协同作用(q >1.15),余浓度联合应用显示相加作用(0.85<q<1.15)。联合用药组与同等剂量NDGA各单独用药组相比差异具有显著性(*P<0.05,**P<0.01)。(2) TUNEL染色结果显示经NS-398(160μmol/L)和NDGA(200μmol/L)单独和联合应用48h后均可诱导人肝癌细胞株HepG2发生凋亡,凋亡细胞胞核成棕色,核固缩,大小不一;非凋亡细胞细胞核淡蓝紫色,核形态大小较一致。联合用药组较各单独用药组及对照组凋亡指数增高。(3)流式细胞术结果显示经NS-398(160μmol/L)和NDGA(200μmol/L)单独和联合应用48h后均可诱导人肝癌细胞株HepG2发生凋亡,在DNA直方图上G0/G1期前可见亚G1峰即凋亡峰,NS-398与NDGA联合应用48h后凋亡率明显高于各单独用药组,提示两药合用对诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡有协同作用。(4) RT-PCR检测bcl-2 mRNA的结果显示NS-398(160μmol/L)或NDGA(200μmol/L)单独和联合用药48h后HepG2细胞bcl-2 mRNA的表达均降低,两药联合用药组人肝癌HepG2细胞bcl-2 mRNA表达明显低于NS-398或NDGA单独用药组,差异具有显著性(**P<0.01)。结论:(1)单独应用NS-398或NDGA对于人肝癌细胞株HepG2均有增殖抑制作用,且呈剂量和时间效应关系。NS-398和NDGA联合用药对人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制具有协同作用。(2)单独应用NS-398或NDGA对于人肝癌细胞株HepG2均有诱导凋亡作用; NS-398和NDGA联合用药对于人肝癌细胞株HepG2有协同诱导凋亡作用,并可能与抑制bcl-2 mRNA表达的作用增强有关。